周成銘， 王亞楠， 張立明，2，3， 王文蘋，2，3*， 張萬年，2，3*

（1.寧夏醫(yī)科大學藥學院，寧夏銀川750004；2.寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術研究中心，寧夏銀川750004；3.寧夏醫(yī)科大學回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏銀川750004）

回藥哈黑里里方提取物納米乳及其原位凝膠滴鼻液的研究

周成銘1， 王亞楠1， 張立明1，2，3， 王文蘋1，2，3*， 張萬年1，2，3*

（1.寧夏醫(yī)科大學藥學院，寧夏銀川750004；2.寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術研究中心，寧夏銀川750004；3.寧夏醫(yī)科大學回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏銀川750004）

目的制備哈黑里里方 （乳香、胡椒、沒藥等）提取物納米乳及其原位凝膠滴鼻液。方法用哈黑里里方超臨界流體提取物、肉豆蔻酸異丙酯與乳化劑制備納米乳，載入以去乙酰結冷膠為主要基質的體系得到鼻用原位凝膠液，采用偽三元相圖選擇納米乳處方，并綜合評價滴鼻液的性能。結果以吐溫80-甘油 （2∶1）為混合乳化劑在偽三元相圖納米乳區(qū)的面積最大，當提取物∶混合乳化劑∶水質量比為0.20∶0.40∶0.40時制得的納米乳平均粒徑60.3 nm；以0.5%去乙酰結冷膠為基質、0.2%海藻酸鈉為增黏劑時體系的膠凝行為最適，載納米乳原位凝膠液與人工鼻液混合能形成強度、持水性和流變性均良好的凝膠。結論所得離子敏感型納米乳原位凝膠滴鼻液粒徑細小、穩(wěn)定，適合性也符合鼻腔給藥需求。

哈黑里里方；提取物；納米乳；原位凝膠；滴鼻液

回醫(yī)藥學是阿拉伯醫(yī)藥學與中國醫(yī)藥學高度融合的民族性醫(yī)藥學，是東西方醫(yī)藥文化交流的結晶，具有深厚的回民族特色，尤其擅用香藥［1］。哈黑里里方載于回醫(yī)藥學典籍 《回回藥方》［2］，由乳香、胡椒、沒藥、五倍子、番梔子花蕊 （西紅花）、扁豆、撒額因 （阿魏）、蘆薈、白蓽撥、麝香、膃肭臍 （海狗腎）組成，將上述藥材碾成粉末與勿忘草水調和，滴鼻用。研究［3］證實，哈黑里里方能夠改善缺血性腦卒中后遺癥患者癥狀，并能積極有效地干預該癥病理進程。但該方工藝粗糙、用藥量大、使用不便，為了改進劑型和工藝使之更符合現(xiàn)代用藥需求。課題組前期采用超臨界流體萃取法對處方藥材進行提取［4］，藥材出油率為5.45%（g/g），采用GC-MS法分析提取物（油）成分，其中胡椒堿、愈創(chuàng)醇、沒食子酸等在該藥材提取物中占的比例較高。針對提取物的特性以及給藥需求，本研究利用納米乳和原位凝膠制劑技術對方劑提取物進行處置，并對所得制劑質量進行初步評價。

1 儀器與試藥

PL203電子分析天平 （上海精密科學儀器有限公司）；NICOMPTM380 ZLS亞微粒徑分析儀（美國PSS公司）；漩渦混合器 （太倉市科教器材廠）；DV-Ⅲ流變儀（美國博勒飛公司）；PHS-3 E型pH計 （上海儀電科學儀器股份有限公司）。

哈黑里里方提取物 （寧夏醫(yī)科大學藥學院自制）；肉豆蔻酸異丙酯 （國藥集團化學試劑有限公司，20130107）；1，2-丙二醇 （天津市瑞金特化學品有限公司，20130504）；吐溫-80（Tween-80，天津市大茂化學試劑廠，20131026）；Triton X-100（北京索萊寶科技有限公司，20130608）；D-α生育酚聚乙二醇琥珀酸酯 （TPGS，武漢國邦達醫(yī)藥化工有限公司，G20140201）；甘油 （天津市大茂化學試劑廠，20130414）；聚乙二醇400（PEG-400，天津市大茂化學試劑廠，20130504）；去乙酰結冷膠（Deacetylated gellan gurn，DGG，浙江天偉生化工程有限公司，130725）；海藻酸鈉 （天津市大茂化學試劑廠，F(xiàn)20130925）；水為去離子水 （自制），其余試劑均為分析純 （國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 納米乳的處方篩選

2.1.1 偽三元相圖的制備［5］室溫下，以肉豆蔻酸異丙酯：提取物 （1∶1）做為油相，將混合乳化劑與油相依次按照1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1（m/m）不同比例混勻后逐滴加水，并渦旋混勻，當體系由暗黃色油體變?yōu)榘胪该饔兴{色乳光時為臨界點［6］，計算各相變點時混合乳化劑、油相、水相的重量百分比，利用ORIGIN7.5軟件繪制偽三元相圖（陰影部分為納米乳區(qū)）。

2.1.2 乳化劑的篩選 固定助乳化劑為甘油，乳化劑與助乳化劑比值Km為2∶1，分別以TPGS、TritonX-100和Tween-80為乳化劑繪制偽三元相圖，結果見圖1。

圖1 不同乳化劑的偽三元相圖Fig.1 Pseudoternary phase diagram s of different emulsifiers

由圖1可知，納米乳區(qū)域面積大小依次為Tween-80＞TritonX-100＞TPGS，其中以Tween-80作為乳化劑與揮發(fā)油混合稀釋后乳化效果最佳，能形成均勻穩(wěn)定的納米乳，故選擇Tween-80為乳化劑。2.1.3 助乳化劑的篩選 固定乳化劑為Tween-80，Km=2∶1，分別以1，2-丙二醇、PEG-400和甘油為助乳化劑繪制偽三元相圖，結果見圖2。

由圖2可知，納米乳區(qū)域面積大小依次為甘油＞PEG-400＞1，2-丙二醇，甘油助乳化效果最佳。且甘油具有保濕作用、無毒無刺激，適于鼻腔給藥，因此選擇甘油為助乳化劑。

圖2 不同助乳化劑的偽三元相圖Fig.2 Pseudoternary phase diagrams in different auxiliary emulsifiers

2.1.4 Km值的確定 分別將Tween-80與甘油按照Km=1∶2、1∶1、2∶1的比例混合，繪制偽三元相圖，結果見圖3。

圖3 不同Km的偽三元相圖Fig.3 Pseudoternary phase diagram s of different Km values

由圖3可知，當Km=2∶1時所得相圖中納米乳區(qū)域面積最大，當油相比例高達25%時仍可形成納米乳。繼續(xù)增加乳化劑用量可能乳化效果更佳，但考慮到乳化劑用量過大可能帶來的刺激性問題，故將納米乳處方中的Km值定為2∶1。

2.1.5 納米乳處方的確定 根據(jù)上述結果，稱取適量油相 （肉豆蔻酸異丙酯 ∶提取物=1∶1），然后將混合乳化劑（Tween-80∶甘油=2∶1）加入到油相中，渦旋均勻，逐滴加水到混合油相當中；當油-乳-水0.20∶0.40∶0.40時，體系載藥量較高，形成的納米乳外觀半透明、具淡藍色乳光，且此時乳化劑用量相對較低。

2.2 納米乳的初步評價

2.2.1 外觀 哈黑里里方提取物如圖4-a所示；納米乳如圖4-b所示。

由圖4可知，提取物 （圖4-a）為暗紅色黏稠狀油體、氣味芳香，與混合乳化劑混勻，采用滴水法制得納米乳 （圖4-b）為有藍色乳光半透明的液體，流動性良好。

圖4 提取物和納米乳外觀圖Fig.4 Appearance of extract and its nanoemulsion

2.2.2 粒徑及Zeta電位的測定 采用NICOMPTM380 ZLS亞微粒徑分析儀分別測定納米乳的粒徑分布和Zeta電位。由圖5知，平均粒徑 （60.3± 10.8）nm，PI（Polydispersity Index）0.277± 0.15。Zeta電位（-1.63±0.02）mV，可能是由于吐溫是非離子表面活性劑。

圖5 納米乳的粒徑和PIFig.5 Particle size and PIof nanoemulsion

2.2.3 離心穩(wěn)定性考察 12 000 r/min離心20 min后納米乳與離心前相比無明顯差異，體系不分層、無沉淀、均勻半透明，較穩(wěn)定。

2.3 鼻用原位凝膠的制備

2.3.1 人工鼻液的配制 根據(jù)文獻［7］配制，使1 L去離子水中含氯化鈉7.91 g、碳酸氫鈉2.56 g、氯化鉀3.68 g和氯化鈣0.51 g，溶解混勻即得。

2.3.2 凝膠基質的篩選 參考文獻［8］方法，分別以不同濃度的DGG為基質、海藻酸鈉為增黏劑配制凝膠溶液，將凝膠液與人工鼻液按比例 （V/ V，25∶7）混勻，體系迅速膠凝 （30 s），使用DV-Ⅲ流變儀考察體系的黏度變化 （63號轉子，25℃，轉速50 r/min），結果見圖6。

圖6 原位凝膠材料及濃度對體系膠凝行為的影響Fig.6 Effect of in-situ gel on system atic gelling behavior of the system

原位凝膠系統(tǒng)在體外為低黏度的流體，生理條件下如溫度，pH值等，自身將會產生溶液—凝膠的相轉變［9］。由圖6可知，凝膠黏度隨DGG質量分數(shù)增大而增大，0.2%海藻酸鈉的加入能進一步提高體系黏度。與人工鼻液混合后，體系黏度迅速提高。其中，含0.5%DGG和0.2%海藻酸鈉的體系與人工鼻液混合前后的黏度差值最大，形成的凝膠穩(wěn)定。低黏度的溶液滴入鼻腔后容易流出，且鼻纖毛的清除作用會使制劑滯留時間短，而黏度太高不易滴出和使用，因此選擇“0.5%DGG+ 0.2%海藻酸鈉”作為凝膠基質。

2.3.3 載納米乳鼻用原位凝膠制備 將0.67 g油相、0.89 g Tween-80和0.44 g甘油加至試管中渦旋混勻，逐滴加入去離子水至形成納米乳，再將含0.5%DGG及0.2%海藻酸鈉的凝膠液與納米乳以3∶1（V/V）的比例混合均勻，即得納米乳原位凝膠劑。

2.4 原位凝膠的體外評價

2.4.1 外觀 考察載納米乳原位凝膠液與人工鼻液混合前后的外觀，結果見圖7。

圖7 制劑膠凝前后的外觀圖Fig.7 Preparation appearance before and after being m ixed w ith artificial nasal drops

由圖7可知，未加人工鼻液的納米乳原位凝膠液 （圖7-a）為略帶乳光的半透明黏性溶液、流動性良好；加人工鼻液后體系 （圖7-b）凝膠化、顏色加深，倒置后不下流。

2.4.2 黏度測定 采用 《中國藥典》2010年版二部附錄ⅥG項下黏度測定第二法，測得原位凝膠液的平均黏度 （470.27±0.57）MPa·s（n=3），與人工鼻液混合后平均黏度驟升至 （5014.33± 30.44）MPa·s（n=3）。表明體系具有良好的膠凝性能。

2.4.3 pH測定 取適量凝膠樣品用去離子水稀釋100倍，用PHS-3E型pH計測得納米乳原位凝膠的平均pH值為5.57±0.04（n=3），與正常人鼻腔分泌液pH值 （5.5～6.5）相近［10］，無刺激性，適合鼻腔給藥。

2.4.4 原位凝膠強度考察［11］取原位凝膠樣品加入含有適量人工鼻液試管中，置于120 r/min（37℃）條件下氣浴振蕩，觀察并記錄凝膠溶蝕所需的時間。結果凝膠溶蝕時間為 （59±0.57）min（n=3）。這是因為所制備的凝膠為水凝膠，在弱酸性環(huán)境中，凝膠中高分子鏈變得卷曲，鏈間的疏水作用增強，從而使凝膠與水的作用減弱，導致凝膠溶蝕。Giammona等［12］采用PHEA為主體材料制得的凝膠也表現(xiàn)出同樣的性質。

2.4.5 原位凝膠持水性考察［13］取原位凝膠與人工鼻液1∶1混合，靜置1 min，轉移至超濾離心管內管中 （避免破壞凝膠表面），稱重 （記為m0），以4 000 r/min離心，于不同時間點取出內管分別稱重 （記為m），以m/m0的值反應原位凝膠在外力作用下持水能力隨時間的變化。結果發(fā)現(xiàn)凝膠在外力離心作用下30 min后持水率接近100%，凝膠持水性能良好。

2.4.6 流變學性質考察 采用DV-Ⅲ流變儀，分別考察原位凝膠在加入人工鼻液前后剪切速率增大時黏度和剪切應力的變化情況?？刂茰囟葹?5℃，選擇小量樣品適配器 （SC4-31號轉子），結果見圖8。

由圖8可知，未加人工鼻液條件下，黏度和剪切應力隨剪切率的變化均不顯著；加入人工鼻液后體系形成凝膠，黏度隨剪切率增大而變稀，剪切應力隨剪切速率增大迅速上升。隨著剪切力作用的增加，體系的黏度減小，但當體系黏度降低到一定值后，黏度的變化趨于平穩(wěn)，可能是由于凝膠具有剪切變稀的特性，剪切速率增大破壞了凝膠規(guī)則的空間結構，降低其黏度。

3 討論

圖8 剪切速率對體系黏度和剪切應力的影響Fig.8 Effect of shear rate on viscosity and shear stress of the system

原位凝膠有pH敏感、溫度敏感和離子敏感［14］3種類型。其中，pH敏感型原位凝膠體外情況下一般為酸性，較低的pH對于鼻部刺激性較大，不宜鼻部給藥；溫度敏感型原位凝膠配方所需基質濃度高、常溫下黏度大，不易滴出。鼻用原位凝膠必需于鼻黏膜呈現(xiàn)良好的膠凝能力及藥物緩釋作用，且無明顯鼻黏膜刺激性。本研究結合DGG的陽離子響應特性和鼻腔的富陽離子環(huán)境，制備離子敏感型鼻用原位凝膠。DGG是一種對陽離子敏感的線性多糖，接觸生理濃度的陽離子 （Na+、K+、Ca2+）時，結構中的葡萄糖醛酸被中和，結構發(fā)生陽離子介導的凝聚，形成半固體凝膠態(tài)［15］。人鼻腔分泌物富含Na+、K+、Ca+陽離子，離子濃度相對固定［16］，使其能夠在鼻腔形成黏度理想的凝膠。

實驗結果表明，以0.5%DGG和0.2%海藻酸鈉制備的凝膠基質最為適宜，既具有離子敏感特性，又避免黏度過高給制備及使用帶來不便。流變學結果顯示，所制原位凝膠具有假塑性流體學特性，即黏度隨剪切率增大而降低 （切稀作用），這種流變學特性對對鼻腔的刺激較小，更易被患者接受；另外，這種流變學特性也使凝膠溶液易于攪拌、灌裝，從而降低工業(yè)化生產的難度和成本。

4 結論

本研究針對回藥哈黑里里方的鼻腔給藥需求及提取物特點，將提取物制成納米乳并載入離子型原位凝膠液中，不僅能使提取物高度分散為納米級、利于透過鼻黏膜吸收入腦，且能顯著延長給藥局部的滯留時間、可望改善生物利用度，該制劑體系黏度小、便于制備和使用。本研究為回醫(yī)藥經方的現(xiàn)代研究和應用提供參考，也為相關新產品開發(fā)奠定了基礎。

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Nanoemulsion and in-situ gel nasal drops of Haheililiextract

ZHOU Cheng-ming1， WANG Ya-nan1， ZHANG Li-ming1，2，3， WANGWen-ping1，2，3*，ZHANGWan-nian1，2，3*
（1.Schoolof Pharmacy，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China；2.Ningxia Engineering&Technology Research Center For Modernization of HuiMedicine，Yinchuan 750004，China；3.Ningxia Medical University，Key Laboratory of Hui EthnicMedicineModernization，Ministry of Education，Yinchuan 750004，China）

AIMTo prepare nasal drops composed of nanoemulsion and in-situ gel of the oil fraction extracted from Hahelili Formula（Olibanum，Piperis Fructus，Myrrha，etc）.METHODSThe oil fraction was obtained by supercritical fluid extraction.The nanoemulsion of oil extractwas prepared using isopropylmyristate and emulsifiers according to pseudo-ternary phase diagrams.The nanoemulsion was loaded into deacetylated gellan gum to form in-situ gel system for nasaladministration，and the performance of in-situ gelwas evaluated.RESULTSThe co-surfactant system of tween-80 and glycerinum（2∶1）showed themaximum nanoemulsion area.Themean particle size of obtained nanoemulsion was60.3 nm at 0.20∶0.40∶0.40 ratio of oil extract，emulsifier and water. The nanoemulsion-loaded in situ gel，consisting of0.5%gellan gum and 0.2%sodium alginate as gellingmaterials，showed favorable gel formation.Strong gelwith excellentwater-binding capacity and rheological property could be formed after being mixed with artificial nasal drops.CONCLUSIONThe obtained nanoemulsion possesses small particle size and good stability，and the in situ gel system shows excellentgelling property which canmeet the requirementof intranasal administration.

Hahelili Formula；extract；nanoemulsion；in situ gel；intranasal administration

R944

：A

：1001-1528（2015）06-1210-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.012

2014-10-15

國家科技支撐項目 （2013BAI11B07）；寧夏回族自治區(qū)科技攻關計劃項目 （2013）

周成銘 （1987—），男，碩士，研究方向為新型載藥材料及給藥系統(tǒng)。Tel：18295076567，E-mail：z_dahai0806@126.com

*通信作者：王文蘋 （1977—），女，博士，教授，研究方向為新型載藥材料及給藥系統(tǒng)。Tel：（0951）-6880581，E-mail：wangwenpingg@sina.com張萬年 （1947—），男，教授，博士生導師，研究方向為藥物分子設計及抗腫瘤藥物。Tel： （0951）6980189，E-mail：zhangwnk@sina.com