于冬梅， 劉 熙， 李冬梅， 丁 云， 李春艷

(大理大學藥學與化學學院，云南 大理671000)

云南漾濞泡核桃Juglans sigillata D. 系胡桃科Juglandaceae 胡桃屬Juglans 植物的成熟果實，主產(chǎn)于云南省大理白族自治州漾濞彝族自治縣。核桃用藥歷史悠久，有記載稱其對皮炎、慢性氣管炎、泌尿系統(tǒng)結(jié)石、濕疹及痢疾等疾病療效顯著［1］。唐代孟憲著《食療本草》中記載，核桃“通經(jīng)絡、開胃、潤血脈、使骨肉光滑”;明代李時珍著《本草綱目》對核桃仁的藥用價值概括是“溫肺潤腸、益命門、補氣養(yǎng)血、治虛寒咳喘、潤燥化痰、利三焦等［2］”。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，胡桃屬植物所含化學成分的結(jié)構(gòu)較多，并具有抗菌、心血管保護、清除氧自由基和鎮(zhèn)痛等藥理作用［3-6］。近年來有文獻報道［7］核桃殼提取物具有一定抗癌活性，如胡桃醌對小鼠自發(fā)性、移植性乳腺癌均有明顯的抑制作用［8］。胡桃楸根部提取物對人結(jié)腸癌(HT-29)有細胞毒作用［9］。但對云南漾濞泡核桃殼抗肺癌、肝癌及對人正常肝細胞毒性方面的研究較少，因此本研究以兩株肺癌細胞(NCI-H292、NCI-H661)、兩株肝癌細胞(HepG2、Huh-7)和一株正常肝細胞(L-02)為研究對象，初步探討核桃殼醇沉物的體外抗腫瘤活性及毒性作用，為核桃殼抗腫瘤機制的進一步研究及其藥用開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 無菌操作臺(Yj-1450 型)購自蘇州安泰空氣技術有限公司;倒置相差顯微鏡(OLympus IX-7 型);水套式CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司);高壓滅菌器(Es-315 型) (日本Tomykogyo 公司);連續(xù)波長酶標儀(BIO-Tek 公司)。

1.2 材料 漾濞泡核桃殼Juglans sigillata D. 采自云南漾濞縣，經(jīng)大理學院生藥教研室夏從龍教授鑒定為胡桃科Juglandaceae 胡桃屬Juglans 植物的成熟果實。HTK-DEF、HTK-D 分別為其五倍醇沉物、一倍醇沉物;DDP (順鉑)為粉針劑(山東羅欣藥業(yè)股份有限公司);DMEM 培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)購自Gibco 公司;0.25%胰蛋白酶購自Thermo 公司;噻唑藍(MTT)、Hepes 和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma 公司。0.22 μm 微孔濾膜購自Millipore公司。

1.3 細胞株 NCI-H292 人肺癌細胞、NCI-H661 人大細胞肺癌;HepG-2、Huh-7 人肝癌細胞;L0-2 人正常肝細胞;均購自中國科學院昆明動物研究所細胞庫。

2 方法

2.1 樣品配制 將HTK-DEF、HTK-D 粉末及DDP 用含10%滅活FBS 的DMEM 培養(yǎng)基(含HEPES 4.746 g/L，青霉素100 mg/L，鏈霉素100 mg/L)超聲溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的溶液，用0.22 μm 的濾膜過濾后，梯度稀釋成終質(zhì)量濃度為250、62.5、15.63、3.91、0.98 μg/mL的樣品溶液。

2.2 細胞接種 NCI-H292、NCI-H661、HepG2、Huh-7、L0-2 分別用含10%滅活FBS 的DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的上述細胞，用0.25%胰酶消化后，離心，棄去上清液，用完全培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)至1 ×105個/mL，接種于96 孔板，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

2.3 HTK-DEF、HTK-D 對NCI-H292、NCI-H661、HepG2、Huh-7 增殖的影響 已培養(yǎng)12 h 的NCI-H292、NCI-H661、HepG2、Huh-7 培養(yǎng)板，棄去上清液，分別在每個實驗孔中加入不同質(zhì)量濃度的HTK-DEF、HTK-D 樣品溶液，每個質(zhì)量濃度設3 個復孔，同時設置陽性對照組(DDP)、陰性對照組和空白對照組。放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 后，棄去上清液，加入5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，分別加入DMSO 溶液150 μL/孔，待紫色結(jié)晶溶解后，在λ570檢測各孔OD 值，按下式計算抑制率。

抑制率(%) = ［1 - (OD實驗-OD空白)/ (OD陰性-OD空白)］ ×100%

2.4 HTK-DEF、HTK-D 對L0-2 細胞的作用 取已培養(yǎng)12 h 的L0-2 培養(yǎng)板，棄去上清液，加入梯度濃度HTK-DEF、HTK-D 溶液，每個質(zhì)量濃度設置3 個復孔，同時設置陰性對照組和空白對照組。將96 孔板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 后，棄去上清液，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，再分別加入DMSO 溶液150 μL，待紫色結(jié)晶溶解后，在λ570檢測各孔OD 值，按下式計算出存活率。

存 活 率 (%) = (OD實驗- OD空白)/ (OD陰性-OD空白) ×100%

2.5 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行處理，數(shù)據(jù)以±s 表示，各組數(shù)據(jù)進行t 檢驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 漾濞泡核桃殼五倍醇沉物HTK-DEF、一倍醇沉物HTK-D 作用72 h 時對人肺、肝癌細胞增殖的影響 HTKDEF、HTK-D 作用72 h 時對NCI-H292、NCI-H661、HepG2、Huh-7 增殖的影響結(jié)果見表1。從表中可知:與陰性對照組比較，陽性藥物順鉑在質(zhì)量濃度1 000 ～0.98 μg/mL 對NCI-H292 細胞均有抑制作用(P ＜0.01)，且抑制作用表現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性;HTK-DEF 在1 000 μg/mL 時，與陰性對照組比較，NCI-H292、NCI-H661、HepG2、Huh-7 細胞的增殖均被抑制，其抑制作用具有統(tǒng)計學差異 (P ＜0.01)。隨著HTK-DEF 質(zhì)量濃度的降低，對肺癌、肝癌細胞的抑制作用也減弱。平行濃度下，HTK-DEF 對NCIH292、HepG-2、Huh-7 的抑制作用強，抑制NCI-H661 細胞增殖作用弱。HTK-D 在1 000 ～15.63 μg/mL 時對NCI-H292、NCI-H661 均有抑制作用(P ＜0.05)，在1 000 μg/mL 時，HTK-D 對兩株肝癌細胞的抑制作用強，抑制兩株肺癌細胞的作用弱。

表1 作用72 h 時HTK-DEF、HTK-D 對NCI-H292、NCI-H661、HepG2、Huh-7 增殖作用的影響(±s，n=3)

表1 作用72 h 時HTK-DEF、HTK-D 對NCI-H292、NCI-H661、HepG2、Huh-7 增殖作用的影響(±s，n=3)

注:與陰性對照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

樣品 質(zhì)量濃度/(μg·mL -1) 抑制率/%NCI-H292 NCI-H661 HepG2 Huh-7 HTK-DEF 1000 64.56 ± 0.02＊＊ 33.39 ± 0.02＊＊ 67.21 ± 0.00＊＊ 53.36 ± 0.02＊＊HTK-DEF 250 26.06 ± 0.01* 25.76 ± 0.02* 22.13 ± 0.02* 35.34 ± 0.02*HTK-DEF 62.5 21.67 ± 0.01* 17.13 ± 0.04 18.03 ± 0.02 13.13 ± 0.04 HTK-DEF 15.63 14.39 ± 0.02 7.401 ± 0.01 13.93 ± 0.03 9.54 ± 0.02 HTK-DEF 3.91 10.50 ± 0.01 6.18 ± 0.01 9.84 ± 0.04 6.77 ± 0.04 HTK-DEF 0.98 0.61 ± 0.01 0.12 ± 0.03 1.64 ± 0.01 -2.22 ± 0.05 HTK-D 1000 46.62 ± 0.02＊＊ 41.31 ± 0.02＊＊ 55.04 ± 0.02＊＊ 67.49 ± 0.06＊＊HTK-D 250 43.65 ± 0.06＊＊ 37.04 ± 0.03* 14.71 ± 0.02 38.81 ± 0.05*HTK-D 62.5 43.65 ± 0.02＊＊ 28.76 ± 0.03* 11.76 ± 0.02 30.74 ± 0.05*HTK-D 15.63 35.72 ± 0.08* 21.24 ± 0.03* 10.92 ± 0.02 5.77 ± 0.09 HTK-D 3.91 34.10 ± 0.05* 18.04 ± 0.03 2.52 ± 0.02 3.59 ± 0.08 HTK-D 0.98 30.45 ± 0.12* 5.84 ± 0.02 -4.20 ± 0.03 3.65 ± 0.03 DDP 1000 87.94 ± 0.00＊＊ 81.08 ± 0.00＊＊ 76.64 ± 0.06＊＊ 86.93 ± 0.00＊＊DDP 250 87.44 ± 0.00＊＊ 80.75 ± 0.01＊＊ 62.30 ± 0.09＊＊ 86.01 ± 0.01＊＊DDP 62.5 87.36 ± 0.00＊＊ 80.54 ± 0.00＊＊ 68.44 ± 0.08＊＊ 86.00 ± 0.00＊＊DDP 15.63 86.71 ± 0.01＊＊ 75.05 ± 0.01＊＊ 63.93 ± 0.09＊＊ 85.55 ± 0.00＊＊DDP 3.91 61.37 ± 0.01＊＊ 28.71 ± 0.01* 49.18 ± 0.12＊＊ 82.11 ± 0.01＊＊DDP 0.98 40.89 ± 0.01＊＊ 27.96 ± 0.00* 35.25 ± 0.16* 60.78 ± 0.02＊＊陰性對照組0.00 ± 0.09 0.00 ± 0.04 0.00 ± 0.01 0.00 ± 0.05 0

3.2 漾濞泡核桃殼醇沉物72 h 時對L0-2 細胞的作用 由于體內(nèi)實驗中，鑒于藥物的無細胞選擇性及肝臟通常是毒性作用的靶器官。故在實驗中，以L0-2 細胞為模型，考察云南漾濞泡核桃醇沉物對人正常肝細胞的毒性作用。從中篩選出活性高、毒性小的抗腫瘤提取物。從表2 中結(jié)果可知:與不同質(zhì)量濃度梯度的HTK-DEF、HTK-D 共同孵育72 h 后，高質(zhì)量濃度下(1 000 μg/mL)，HTK-DEF、HTK-D對L0-2 細胞的存活率分別為73.19%、71.91%。而在此質(zhì)量濃度下，HTK-DEF 對NCI-H292、NCI-661、HepG2、Huh-7 的抑制率分別為64.56%、33.39%、67.21%、53.36%;HTK-D 對NCI-H292、NCI-661、HepG2、Huh-7 的抑制率分別為46.62%、41.31%、55.04%、67.49%。提示HTKDEF、HTK-D 在對人肝癌細胞、肺癌細胞發(fā)揮抑制作用同時對正常人肝細胞毒性小。

表2 作用72 h 時HTK-DEF、HTK-D 對L0-2 細胞的作用

4 討論

近年來，隨著生活水平的提高、生態(tài)環(huán)境的改變及生活壓力增大，癌癥已呈上升趨勢，其中肝癌和肺癌是我國常見的兩大惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年約有140 萬人死于肺癌，而我國每年肺癌的發(fā)病人數(shù)約70 萬，排名惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率首位［10］。肺癌是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤，絕大多數(shù)起源于支氣管黏膜和細支氣管肺泡，故又稱支氣管肺癌［11-12］，其發(fā)病率和死亡率增長最快，是對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。肺癌可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌占80% 左右［13］，其首選治療方法是手術，但大多數(shù)患者確診時已經(jīng)是癌癥晚期［14］，失去治療機會。另外，50%以上患者盡管經(jīng)過手術、放化療等積極治療，最終仍會出現(xiàn)局部復發(fā)或遠端轉(zhuǎn)移［15-17］，并且其毒副作用大，患者難以承受。肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥的第三大死亡原因，其惡性度極高、進展迅速、預后差，嚴重危害人類生命和健康［18］。據(jù)報道［19］，我國是肝癌發(fā)病大國，發(fā)病人數(shù)占全球的55%，每年約有13 萬人死于肝癌［20-21］。肝癌，多指原發(fā)性肝癌，是發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤［22］。肝臟只有表面包膜具有神經(jīng)，癌細胞侵入包膜內(nèi)才會引起痛感，而且肝臟只要剩下1/5 仍可維持正常功能，因此肝臟破壞了80%時，才會產(chǎn)生肝功能失調(diào)癥狀，故肝癌確診時基本屬于中晚期，而且肝臟的血液供應豐富，容易在器官內(nèi)外作血源性轉(zhuǎn)移，導致治療上的困難。上述兩類癌癥患者在確診時多數(shù)屬于晚期，已經(jīng)失去手術的最佳時機，并且放化療在殺滅癌細胞的同時對患者機體也會造成損害，毒副反應大且預后較差，療效不佳。因此探尋一種副作用小、高效低毒的抗腫瘤藥物則成為當前研究的熱點。

中藥具有多靶點、多途徑的協(xié)同作用，在癌癥放化療的減毒增效及術后防復發(fā)轉(zhuǎn)移等方面獨具優(yōu)勢。因此，從中草藥中尋找高效低毒的抗癌藥物具有極其重要的現(xiàn)實意義。核桃楸是我國經(jīng)濟樹種分布最廣泛的樹種之一，資源豐富。國外學者報道了核桃葉、果殼及新鮮的果皮中的醌類和酚性成分抗氧化活性良好，能有效清除DPPH 等自由基［23-28］。胡博路等［29］報道了核桃殼能清除羥基自由基［·OH］，并可有效抑制脂質(zhì)過氧化。姚煥英等［30］報道了核桃有抗腫瘤、消炎、鎮(zhèn)痛及抗氧化等生理作用。這些研究顯示了以核桃殼為藥源研發(fā)的理論基礎及提示核桃屬植物中有抗癌作用的成分。本研究從細胞水平探討云南漾濞泡核桃殼醇沉物 (HTK-DEF、HTK-D)對人肺癌細胞(NCI-H292、NCI-H661)、肝癌細胞 (HepG2、Huh-7)增殖作用的影響和對正常人肝細胞(L0-2)的作用，結(jié)果表明:漾濞泡核桃殼五倍醇物 (HTK-DEF)、一倍醇沉物(HTK-D)均對NCI-H292、NCI-H661、HepG2、Huh-7 有增殖抑制作用(P ＜0.05)，且隨著濃度降低，抑制作用減弱。高濃度下，漾濞泡核桃殼五倍醇沉物(HTK-DEF)對NCIH292、HepG2、Huh-7 細胞增殖抑制作用較好，而漾濞泡核桃殼一倍醇沉物(HTK-D)則對兩株肝癌細胞(HepG2、Huh-7)有較好的抑制作用。L0-2 細胞為人正常肝細胞株，比起其他肝細胞株更接近體內(nèi)正常肝細胞生活狀態(tài)，加之大多數(shù)藥物經(jīng)肝臟代謝轉(zhuǎn)化且是藥物毒性作用的靶器官，故探討云南漾濞泡核桃殼醇沉物對L0-2 細胞的毒性作用，使之篩選得到的醇提物抗癌活性高、毒性小，進而有利于后續(xù)研究及臨床應用的價值，由實驗結(jié)果可知在高質(zhì)量濃度下(1 000 μg/mL)，HTK-DEF、HTK-D 對L0-2 細胞的存活率分別為73.19%、71.91%，其余質(zhì)量濃度下對L0-2 無毒性作用。綜上述云南漾濞核桃殼醇沉物有抗肺癌、肝癌活性，且在高濃度下對人正常肝細胞毒性小。其具體作用機制尚需進一步深入實驗研究與探討。

［1］ 王吉耀. 內(nèi)科學［M］. 北京:人民衛(wèi)生出版社，2005.

［2］ 陳萬青. 解析中國最新癌癥譜［N］. 中國醫(yī)學論壇報，2013-3-7(B4).

［3］ Moran C. Importance of molecular features of non-small cell lung cancer for choice of treatment［J］. Am J Pathol，2011，178(5):1940-1948.

［4］ 王偉麗，高英堂. 肝癌相關基因及相互作用的研究進展［J］. 世界華人消化雜志2008，16(29):3289-3294.

［5］ Stewart B W，Kleihues P. World cancer report ［R］. Lyon:IARC，2003.

［6］ 中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會，中國抗癌協(xié)會臨床腫瘤學協(xié)作委員會，中華醫(yī)學會肝癌學會肝病分會肝癌學組. 原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治專家共識［J］. 臨床腫瘤學雜志，2009，14(3):259-263.

［7］ 饒國輝，劉 生，李潔明，等. 肝癌放射免疫導向治療現(xiàn)狀與展望［J］. 中國熱帶醫(yī)學，2008，8(9):1656-1657.

［8］ 曹志成. 肝癌的病因與診療研究進展［J］. 世界華人消化雜志，2006，14(18):1755-1761.

［9］ 郗榮庭，張毅萍. 中國果樹志(核桃卷)［M］. 北京:中國林業(yè)出版社，1996.

［10］ 聞 平，段秀杰，陳 蕾. 胡桃楸提取物抗深部感染真菌的活性研究［J］. 實用全科聯(lián)學，2006，4(1):94-99.

［11］ 李福雙，申 健，譚桂山. 胡桃屬植物化學成分及藥理作用研究進展［J］. 中成藥，2007，29(10):1490-1495.

［12］ 杜 旭，李玉文，倪 雁，等. 中藥青核桃鎮(zhèn)痛作用研究與展望［J］. 中國中藥雜志，2000，25(1):7 -10.

［13］ 程 剛，周美珍. 易瑞沙在非小細胞肺癌的研究進展［J］.中國腫瘤臨床，2005，32(23):1375-1378.

［14］ 徐亞萍，胡 元，劉安家. 肺癌的病因病機與臨床研究進展［J］. 山西中醫(yī)，2010，26(8):57-58.

［15］ 劉 璟. 肺癌治療的進展［J］. 醫(yī)學理論與實踐，2011，24(1):25-28.

［16］ 孫紅花. 肺癌生物治療的現(xiàn)狀及研究進展［J］. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2010，26(1):77-78.

［17］ 陸 舜，艾星浩. 2010 年肺癌診治進展［J］. 世界臨床藥物，2011，32(2):65-67.

［18］ World Health Organization. Section of cancer information 2008［J］. Geobo Cancer，2012，4(11):3-6.

［19］ Cortés B，Nú?ez I，Cofán M ，et al. Acute effects of high-fat meals enriched with walnuts or olive oil on postprandial endothelial function［J］. J Am Coll Cardiol ，2006，48 (8):1666-1671.

［20］ 施 宏，丁志山. 山核桃屬植物的化學成分及藥理作用研究進展［J］. 中成藥，2009，31(6):924-928.

［21］ 許紹惠，許 弘. 胡桃植物毒性成分及其應用［J］. 沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，1990，21(2):167-170.

［22］ 胡博路，杭 瑚. 核桃清除活性氧自由基的研究［J］. 中草藥，2002，33(3):227-228.

［23］ OLiveira I，Sousa A，F(xiàn)erreira I C，et al. Total phenols，antioxidant potentialand antimicrobial activity of walnut (Juglans regia L.)green husks［J］. Food Chem Toxicol ，2008，46(7):2326-2331.

［24］ Fukuda T，Ito H，Yoshida T. Antioxidative polyphenols from walnuts (Juglans regia L.)［J］. Phytochemistry，2003，63(7):795-801.

［25］ Pereira J A，OLiveira I，Sousa A，et al. Walnut (Juglans regia L.)Leaves:phenolic compounds，antibacterial activity and antioxidant potential of different cultivars［J］. Food Chem Toxicol，2007，45(11):2287-2295.

［26］ Labuckas D O，Maestri D M，Perello M，et al. Phenolics from walnut (Juglans Regia L.)kernels:antioxidant activity and interactions with proteins［J］. Food Chem，2008，107 (2):80-85.

［27］ Li L，Tsao R，Yang R，et al. Polyphenolic profiles and antioxidant activities of heartnut (Juglans ailanthifolia var. cordiformis)and Persian walnut (Juglans regia L.)［J］. J Agric Food Chem，2006，54(21):8033-8040.

［28］ Min B S，Lee S Y，Kim J H，et al. Anti-complement activity of constituents from the stem-bark of Juglans mandshurica［J］. Biol Pharm Bull，2003，26(7):1042-1044.

［29］ 胡博路，杭 瑚. 核桃殼抗氧化和清除活性氧自由基的研究［J］. 研究與探討，2002，23(1):15-16.

［30］ 姚煥英，唐靜成，張鞍靈，等. 核桃屬植物化學成分及生物活性研究［J］. 西北植物學報，2003，23(9):1650-1655.