劉用國， 許嬌紅， 張紅雷

(福建省藥品檢驗所，福建 福州350001)

短葶山麥冬為百合科植物山麥冬屬短葶山麥冬Liriope muscari (Decne.)Baily 的干燥塊根，主產(chǎn)于福建泉州等地，多為栽培品［1］，味甘、微苦，具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心的功效。

短葶山麥冬中含有甾體皂苷類、多糖類等成分，研究表明，其水提物及皂苷類成分具有免疫調(diào)節(jié)、呼吸系統(tǒng)調(diào)節(jié)的功能，可降低血糖、抗腫瘤、抗炎、抗心律失常等功效［2-5］。目前對其多糖的研究報道主要集中于提取分離及多糖的定量測定，對于發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能機(jī)制的研究較少。實驗室前期研究表明，LMP 對正常小鼠及環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠均有一定的免疫調(diào)節(jié)功能［6］。巨噬細(xì)胞通過對異物的吞噬、加工，向機(jī)體免疫系統(tǒng)呈遞抗原以及促進(jìn)自身釋放免疫因子，是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)。因此LMP 的免疫調(diào)節(jié)作用可能與巨噬細(xì)胞活性相關(guān)。本實驗研究LMP 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬、加工及促進(jìn)活性免疫因子分泌的影響，進(jìn)一步闡明其免疫調(diào)節(jié)的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗樣品 短葶山麥冬Liriope muscari (Decne.)Baily的干燥塊根，采用水提醇沉法提取短葶山麥冬粗多糖，Sephadex G-100 凝膠柱對粗多糖進(jìn)行純化、精制［7］，DNS法測定純度為83%。精密稱取LMP 50 mg，紫外照射30 min 滅菌，加入RPMI-1640 培養(yǎng)液5 mL，溶解后用0.22 μm 濾過，即得10 mg/mL 貯備液。

1.2 實驗動物 BALB/c 小鼠，SPF 級，雄性，體質(zhì)量為20 ～23 g，上海市松江區(qū)松聯(lián)實驗動物場，實驗動物生產(chǎn)許可證SCXK (滬)2012-0011。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 儀器 MettlerAE200 電子天平、Heraeus 低溫高速離心機(jī)、Biorad550 酶標(biāo)儀、Thermo 二氧化碳培養(yǎng)箱、Invitrogen 細(xì)胞計數(shù)儀、ESCO A2 生物安全柜、Leica 倒置顯微鏡、Leica DM2000 生物顯微鏡、Leica DFC295 成像系統(tǒng)。

1.3.2 試劑 MTT、脂多糖(LPS)、硫基乙酸鹽肉湯，購自Sigma 公司;PBS 緩沖液(pH 7.2 ～7.4)、RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液，購自杭州吉諾醫(yī)藥生物科技有限公司;胎牛血清(FBS)(Gibco 公司);中性紅細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、牛血清白蛋白(BSA)，購自碧云天公司;TNF-α(批號20131201)、IL-6 (批號20131210)檢測試劑盒，購自BOSTER 公司;Transwell 小室(6.5 mm 直徑，孔徑8.0 μm，聚碳酸酯濾膜)購自Corning 公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 小鼠腹腔注射含5%硫基乙酸鹽肉湯的氯化鈉注射用水1 mL，4 d 后頸椎脫臼處死，浸入95%乙醇30 s，將4 ℃預(yù)冷的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液注入小鼠腹腔，輕揉腹部1 ～2 min，回抽腹腔液體，4 ℃80 ×g 離心10 min，棄上清，用含10%胎牛血清的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液重懸后，將細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)平皿上，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培育3 h 后，輕輕吸棄上清，再用37 ℃預(yù)熱PBS 洗滌3 次，洗去未貼壁細(xì)胞，得純化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液重懸后，調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×106個/mL備用［8］。

1.4.2 給藥設(shè)計與分組 實驗設(shè)LMP 組、LPS 模型組和空白對照組，每組設(shè)3 個復(fù)孔。LMP 貯備液用RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成0.625、1.25、2.5、5 mg/mL 的溶液，實驗時按1 份LMP ∶9 份含10%胎牛血清的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液加入培養(yǎng)體系中，使LMP 終質(zhì)量濃度分別為62.5、125、250、500 μg/mL。精密稱取LPS 適量，用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液超聲溶解，配制成100 μg/mL 的溶液，實驗時按1 份LPS ∶9 份含10%胎牛血清的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液加入培養(yǎng)體系中，使LPS 終質(zhì)量濃度為10 μg/mL。

1.4.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的檢測 分組給藥按“1.4.2”項的方法，調(diào)整細(xì)胞密度為5 ×105個/mL，每孔200 μL 加入到96 孔板中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，吸去培養(yǎng)液，用PBS 洗滌2 次，重新加入200 μL 含10%胎牛血清的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液，并加入20 μL 中性紅染液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，去除含有中性紅染色液的培養(yǎng)液，用PBS 溶液洗滌2 次，每孔加入200 μL 中性紅檢測液，搖床上振蕩10 min，酶標(biāo)儀于540 nm 處測定吸光度值［9］。

1.4.4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞趨化功能的檢測 腹腔巨噬細(xì)胞收集后，用含1% BSA 的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×106個/mL，趨化小室上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入600 μL 不同質(zhì)量濃度的LMP 溶液，小心振蕩使細(xì)胞分布均勻，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，取出小室，棄去小室內(nèi)細(xì)胞懸液，用擦鏡紙擦去小室內(nèi)未遷移細(xì)胞，用PBS 洗滌兩次后用3%戊二醛室溫固定30 min。37 ℃預(yù)熱的PBS 洗凈戊二醛后涼干，然后用0.25%結(jié)晶紫-甲醇染色15 min。37 ℃預(yù)熱的PBS 清洗小室3 次，除去多余染料，切下小室內(nèi)聚碳酸酯膜干燥后，顯微鏡下計數(shù)遷移到小室下表面的巨噬細(xì)胞數(shù)。每個小室隨機(jī)觀察10 個視野。實驗重復(fù)3 次［10］。趨化結(jié)果以趨化指數(shù)(CI)表示。CI% = 給藥組10 個視野下的巨噬細(xì)胞數(shù)/對照組10 個視野下的巨噬細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.5 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6 的檢測 分組給藥按“1.4.2”項的方法，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/mL，每孔200 μL 加入到96 孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，收集上清液，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定，按試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀450 nm 處測定吸光度值［10］。

1.5 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法 實驗數(shù)據(jù)以SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。經(jīng)方差齊性檢驗，方差齊的實驗數(shù)據(jù)采用LSD 法進(jìn)行統(tǒng)計，方差不齊的實驗數(shù)據(jù)采用Tambane 法進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 LMP 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 由圖1 可知，LPS 10 μg/mL 的質(zhì)量濃度可以極大地促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用，與對照組相比，有顯著差異 (P ＜0.01);LMP 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的作用，在62.5 ～500 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，LMP 對中性紅的吞噬能力不斷增加，質(zhì)量濃度為250 μg/mL 時與對照組比較，有顯著差異(P ＜0.05);當(dāng)質(zhì)量濃度為500 μg/mL 時與對照組比較，有顯著差異(P ＜0.01)。說明LMP 可提高腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力，且有一定的劑量相關(guān)性。

圖1 LMP 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響(n=3)

2.2 LMP 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞趨化功能的影響 與對照組相比，LMP 125、250、500 μg/mL 3 組均可顯著提高腹腔巨噬細(xì)胞的趨化指數(shù)CI (P ＜0.01)，對腹腔巨噬細(xì)胞趨化能力提高百分率分別為27.8%、31.0%、74.0%。說明LMP 可以增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞的趨化功能，且對多糖的質(zhì)量濃度有一定依賴性，結(jié)果見圖2。

圖2 LMP 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞趨化功能的影響(n=4)

2.3 LMP 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6 的影響結(jié)果見圖3，LPS 可明顯促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放TNFα、IL-6，與對照組相比，均有顯著性差異(P ＜0.01)。當(dāng)不同質(zhì)量濃度LMP 與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞相作用時，62.5、125 μg/mL 兩個質(zhì)量濃度LMP 對TNF-α 和IL-6 釋放量與對照組相比，無明顯變化(P ＞0.05);當(dāng)LMP 質(zhì)量濃度為250 μg/mL 時，測得TNF-α 的量為(130.0 ±22.4)pg/mL，與對照組相比釋放量雖有所提高，但也無顯著差異(P ＞0.05);測得IL-6 分泌量為(282.5 ±33.4)pg/mL，與對照組相比，有顯著性差異(P ＜0.01);當(dāng)LMP 質(zhì)量濃度為500 μg/mL 時，TNF-α 和IL-6 分泌量均可促進(jìn)，分別達(dá)(185.5 ±15.3)pg/mL 和(352.5 ±28.1)pg/mL。

圖3 LMP 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6 的影響(n=3)

3 討論

巨噬細(xì)胞通過吞噬外來抗原或半抗原，進(jìn)而分泌各種活性免疫因子，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)來保護(hù)機(jī)體。病原菌和免疫因子等可誘導(dǎo)體內(nèi)靜息的巨噬細(xì)胞活化，并分化成熟為活化的巨噬細(xì)胞M1 (classically activated macrophage)和M2(alternatively activated macrophage)［11-12］，M1 細(xì)胞分泌IL-1、IL-6、NO、TNF-α 等炎癥介質(zhì)，刺激Th1 依賴性免疫反應(yīng)，M2 細(xì)胞可分泌抗炎癥因子如IL-10、TGF-β，促進(jìn)Th2免疫應(yīng)答。

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離純化的試驗中，發(fā)現(xiàn)未活化的腹腔巨噬細(xì)胞，即未注射5%硫基乙酸鹽肉湯的小鼠，不僅腹腔巨噬細(xì)胞獲得少，每只約1 ×106個/mL，且對LPS和LMP 刺激時吞噬能力、趨化作用和分泌TNF-α、IL-6 不太敏感。

本實驗結(jié)果顯示250、500 μg/mL LMP 可不同程度的提高腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力、趨化作用和分泌TNF-α、IL-6 的作用。因此初步認(rèn)為LMP 通過提高巨噬細(xì)胞活化能力，刺激Th1 依賴性免疫反應(yīng)，產(chǎn)生炎癥因子來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫。但LMP 通過何種途徑與巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而激活巨噬細(xì)胞，還需要進(jìn)一步實驗觀察來說明。

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