趙 霏， 安利峰， 馬艷慶， 楊克虎

(1. 西北民族大學醫(yī)學院，甘肅蘭州730030;2. 蘭州大學基礎醫(yī)學院循證醫(yī)學中心，甘肅蘭州730000;3. 甘肅省循證醫(yī)學與臨床轉化重點實驗室，甘肅 蘭州730000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種感染肝的閉合環(huán)狀雙鏈DNA 病毒。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，目前全球超過20 億人感染HBV，在中國有超過1.2 億人患慢性乙型肝炎，每年約有35 萬的乙肝患者喪生于由HBV 感染所致的肝硬化、肝功能衰竭和肝細胞癌等疾?。?-2］。目前，臨床治療慢性乙肝的藥物主要有核苷類似物如拉米夫定、恩替卡韋和α-干擾素兩種。然而，由于會產(chǎn)生明顯耐藥性和劑量相關副作用，其治療效果均不盡人意［3-4］。傳統(tǒng)中草藥(Chinese herbal medicines，CHM)在治療肝臟疾病方面歷史悠久。據(jù)報道，中國治療乙肝藥物中有30% ～50%是低成本和低毒性的中草藥，其中80%的慢乙肝患者依靠中草藥治療［5］。循證醫(yī)學資料顯示，與西藥相比，在抑制慢乙肝患者HBV e 抗原和表面抗原血清轉化以及HBV DNA 復制方面，中草藥有同等或更好的效果［5-7］。但由于臨床試驗的方法學低質(zhì)量和發(fā)表偏倚，使得無法驗證其在治療HBV感染上的價值。此外，復雜的草藥制劑和多種成分的中藥配方，使分析中草藥治療乙肝潛在療效和機制方面有所限制。近年來，在細胞和動物模型上研究中草藥治療HBV 感染效果和機制的報道增多。在以感染HBV 細胞株和感染鴨乙肝病毒(DHBV)的雛鴨為實驗組的體內(nèi)外實驗中，發(fā)現(xiàn)某些單味中藥提取物或提取物合成的化合物具有抗HBV有效性和廣泛應用性。本文通過檢索和評價相關文獻，以期完成中草藥抗HBV 病毒效果的系統(tǒng)分析并描述開發(fā)中草藥對抗HBV 感染的前景。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索 電子檢索自建庫至2014 年10 月的中國期刊全文數(shù)據(jù)庫(CNKI)及PubMed 數(shù)據(jù)庫中的中英文文獻。中草藥中英文檢索詞為中藥、草藥、中草藥、中藥單味、單味中藥、單體中藥、提取物、Chinese medicine、herbal、herbs、single herb、plant、extract、CHM;乙型肝炎中英文檢索詞為乙型肝炎、乙肝、鴨乙肝、鴨乙型肝炎、抗病毒、體內(nèi)外、in vitro、in vivo、hepatitis B、duck hepatitis B、HBV、DHBV。檢索策略為中草藥和乙型肝炎分開檢索，各檢索詞間用OR 連接，二者檢索結果用AND 連接進行二次檢索。

1.2 納入排除標準 納入標準:①單味中藥提取物或提取物混合物抗HBV 的研究;②在細胞或動物模型上分析對HBV 感染的體內(nèi)外實驗研究;③體外細胞實驗中報道藥物抗HBV 的半數(shù)有效濃度 (IC50)、半數(shù)細胞毒性濃度(CC50)和治療指數(shù)(TI)等結局指標;④體內(nèi)動物實驗中報道藥物對鴨乙肝病毒抑制率等結局指標。排除標準:①采用多種中草藥組合配方或中藥制劑抗HBV 的研究;②聯(lián)合其他治療方法的研究;③療效評價指標不明確或無法獲取結局指標的文獻;④重復研究或重復發(fā)表的文獻。

1.3 資料提取 為了評估單味中藥的抗HBV 療效，在體外實驗中，提取文獻中藥物的半數(shù)細胞毒性濃度即使宿主細胞生存率下降50%時的藥物濃度(CC50)，和藥物的半數(shù)有效濃度即抑制50%細胞分泌乙肝表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)及釋放HBV DNA 時的藥物濃度(IC50)，并根據(jù)CC50和IC50計算出的治療指數(shù)(TI) (TI = CC50/IC50)。體內(nèi)實驗中，提取藥物對感染DHBV 鴨治療的劑量(g/(kg·d)-1)，動物的數(shù)量，抑制率最高的血漿DHBV DNA 水平和治療持續(xù)時間以及經(jīng)過3 d 處理后的DHBV DNA 的抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)分析 使用Excel 表進行數(shù)據(jù)的管理和分析。體外實驗數(shù)據(jù)提取后按照藥物抑制HBV DNA、HBeAg 和HBsAg 釋放量三方面的治療指數(shù)由高到低進行排列，若沒有確切說明CC50和IC50值，但細胞毒性或抗病毒效果呈劑量依賴性，則當某一用藥濃度下細胞抑制率降低或增長超過50%時，治療指數(shù)用“大于” (＞)或“小于” (＜)某一數(shù)值表示。體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)按照藥物對感染雛鴨血漿DHBV 抑制率的高低進行排列。每組數(shù)據(jù)選取排名前十位的藥物制作統(tǒng)計表。

2 結果

2.1 文獻篩選 共檢索到786 篇文獻，經(jīng)篩選符合納入排除標準共有122 篇文獻，包括66 篇英文和56 篇中文。約81%的文獻(99/122)來自中國大陸。體外細胞實驗研究文獻共有91 篇，報道了從82 種中草藥中提取出的176 種提取物或混合物有抗HBV 效應。實驗所用的HBV 宿主細胞株包括HepG2.2.15，HB-8064、HepA2 MS-G2，HepG2-N10，HepAD38 細胞株以及被DHBV 感染的鴨肝細胞。91%的文獻(83/91)選用HepG2.2.15 細胞株進行研究。符合納入標準的第一篇文獻發(fā)表于1995 年，此后單味中藥提取物體外抗HBV 療效的研究逐年增加，見圖1。

體內(nèi)動物實驗研究文獻共有31 篇，報道了從23 種中草藥中提取和組成的30 種物質(zhì)在感染DHBV 雛鴨上的療效。

2.2 體外實驗中單味中藥提取物抗HBV 效應 納入文獻中報道最多具有抗HBV 效應的中草藥包括苦參(11 篇)，大黃(8 篇)、黃芩(4 篇)、黃芪(4 篇)。研究中評估單味中藥體外抗HBV 效應方法主要包括測量宿主細胞中HBV DNA 的水平和細胞上清中HBeAg 和HBsAg 釋放濃度。根據(jù)CC50與IC50比值計算出的TI 一般用于比較療效和毒性。從24 種中藥中提取出的13 種物質(zhì)和16 種混合物在對HBV DNA，HBeAg 或HBsAg 有位居前十的治療指數(shù)(表1)。在這三方面的測量中，從大黃與黃芩中提取出來的大黃酚8-O-β-D-葡萄糖苷和漢黃芩素這兩種化合物在治療指數(shù)方面有較高的價值。

表1 治療指數(shù)前十位抑制HBV DNA 的單味中藥提取物

2.2.1 通過測量對HBV DNA 釋放抑制率評估單味中藥的抗HBV 效應 從8 種中藥中提取出的3 種物質(zhì)和7 種混合物在抑制HBV DNA 釋放量上治療指數(shù)位居前十(表1)。從大黃中提取出來的大黃酚8-O-β-D-葡萄糖苷，是中醫(yī)最常用的草藥配方［6］，在用藥物處理過的HepG2.2.15 細胞中HBV DNA 釋放量上治療指數(shù)最高(＞270.42)。此外，大黃的乙醇提取物也可抑制HepG2.2.15 細胞外的HBV DNA顯著減少［8］。在HepAD38 細胞中也有類似的結果［9］。同時，在用8-O-β-D-葡萄糖苷和RPEH 進行細胞治療時可以發(fā)現(xiàn)HepG2.2.15 細胞內(nèi)HBV DNA、HBeAg 和HBsAg 水平同時減少。進一步的研究表明，這兩種治療方法都可以減少60%以上的乙肝病毒DNA 復制中間體，并抑制HBV 聚合酶活性。與10 μg/mL拉米夫定相比，DNA 印跡顯示這兩種物質(zhì)在312.5 μg/mL 的質(zhì)量濃度下抑制HBV DNA 產(chǎn)量有更強的效果，而且大黃酚8-O-β-D-葡萄糖苷在抑制療效方面更有效［8］。

陰陽蓮的水提取物和乙醇提取物均可抑制細胞內(nèi)HBV DNA 水平［10］。此外，從黃芩中提取出來單類黃酮分子漢黃芩素，可以抑制HepG2.2.15 細胞外的50%乙型肝炎病毒DNA 的質(zhì)量濃度小于50 μg/mL［11］。MS-G2 細胞中的研究也表明，不閉合環(huán)狀和線性的HBV DNA 濃度在治療組漢黃芩素作用下顯著降低［12］。

2.2.2 通過測量對HBeAg 或HBsAg 分泌量抑制率來評估抗HBV 效應 約90%的文獻報道通過酶聯(lián)免疫吸附試驗來測量HBeAg 和HBsAg 的分泌。從9 種中藥中提取出來的5種物質(zhì)和5 種混合物能減少HepG2.2.15 細胞釋放HBeAg，其治療指數(shù)也位居前十(表2)。從珍珠草中提取出的鞣花酸低至0.07 μg/mL 時就可抑制50% HBeAg 的釋放，其治療指數(shù)最高(＞10 000)。然而，鞣花酸在HepG2.2.15 細胞中不能阻斷HBV 聚合酶活性和HBV DNA 復制［13］。此外，與拉米夫定相比，從黃芩中提取出來的漢黃芩素在同一劑量(4 μg/mL)下能更有效地減少HBeAg 的分泌［11］。紅背葉根正丁醇提取物也可顯著降低HBeAg 分泌水平，治療指數(shù)＞67.1［14］。

從9 種中藥中提取出來的3 種物質(zhì)和7 種混合物能減少HepG2.2.15 細胞上清HBsAg 釋放，其治療指數(shù)也位居前十(表2)。苦參堿是從苦參分離出的主要生物堿，其通過脂質(zhì)體封裝形式在抑制HepG2.2.15 細胞HBV 表面抗原釋放方面有最高的治療指數(shù)。而且與自然苦參堿相比，在同一劑量下，脂質(zhì)體封裝形式對HepG2.2.15 細胞有更小的毒性［15］。在抑制HBsAg 分泌最強的10 種單味中藥中，漢黃芩素的IC50最低(4 μg/mL)。與拉米夫定相比，相同劑量的漢黃芩素能使HepG2.2.15 細胞分泌更少的HBsAg［11］。另一篇文獻中報道黃芩苷對HBeAg 抑制分泌的治療指數(shù)為65.22［16］。艾葉的乙酸乙酯提取物據(jù)報道也具有同樣的效應［17］。

表2 抑制HBeAg 及HBsAg 分泌治療指數(shù)前十位的的單味中藥提取物

2.3 體內(nèi)實驗中單味中藥提取物抗HBV 效應 納入文獻中有26 篇檢測了感染鴨血漿中的DHBV DNA，用藥量從每日1 mg/kg 至每日10 000 mg/kg 不等，并進行了分期為10 d至12 周的持續(xù)治療時間。在感染雛鴨實驗中共研究了7 種中草藥，其中4 種對感染鴨血漿中的DHBV DNA 水平抑制率超過了50%。這4 種草藥是葉下珠、苦參、大黃、黃芩(表3)。研究發(fā)現(xiàn)葉下珠對感染鴨血漿中DNA水平抑制率取決于其來源及每天600 ～10 000 mg/kg 的用藥劑量變化［18-19］。與在HepG2.2.15 細胞實驗上的研究結果一致，大黃水提取物能夠降低感染鴨肝細胞中DNA聚合酶的活性［20］，從黃芩中提取出來的漢黃芩素每天20 mg/kg 能抑制54%感染鴨的肝臟的閉合和線性形式的DNA復制［11］。山芝麻水提取物和丹參中的原兒茶醛也具有類似的效應［21-23］。

表3 鴨肝炎模型血漿中對DHBV DNA 抑制率最高的前十種單味中藥提取物

3 討論

通過分析納入的122 篇文獻，總結了傳統(tǒng)中草藥在體內(nèi)外抗HBV 療效的實驗研究。通過對文獻中治療指數(shù)等數(shù)據(jù)的提取和整理后發(fā)現(xiàn)從24 種中草藥提取的13 種物質(zhì)和11 種提取物的混合物具有較低細胞毒性同時可對細胞中HBV DNA、HBeAg 和HBsAg 的釋放產(chǎn)生強大的抑制效應。24 種中的7 種中草藥用于感染DHBV 鴨模型的研究，從其提取出來的4 種成分對感染鴨模型血漿中DNA 水平的抑制作用超過了50%。而對治療指數(shù)排列前十位的中藥提取物抗HBV 活性的進一步分析表明，抑制HBV DNA 合成效應最小藥物有效質(zhì)量濃度為0.192 μg/mL (青蒿素)，最大有效質(zhì)量濃度為212.36 μg/mL (大黃乙醇提取物)，且大多數(shù)藥物效應呈劑量依賴性，但均高于西藥拉米夫定的有效用藥質(zhì)量濃度(0.03 μg/mL)。而對HBeAg 和HBsAg 分泌抑制作用，葉下珠中提取的鞣花酸和丹參中提取的苦參堿治療指數(shù)分別為13 371.43 和93.46，均遠遠高于拉米夫定(TI=1.16 和2.53)。以上結果提示與傳統(tǒng)西藥拉米夫定相比，單味中藥抑制HBV DNA 的療效較弱。但后者在抑制HBeAg 和HBsAg 分泌方面有較高的治療指數(shù)，可比拉米夫定更有效地減少這兩個抗原的分泌。

約82%的文獻中報道測量細胞上清中HBeAg 和HBsAg分泌量，而只有45 篇(49.45%)文獻報道測量HBV DNA水平。然而，中草藥制劑可使細胞分泌的HBeAg 和HBsAg減少不一定是降低HBV DNA 復制的結果。在這些有高治療指數(shù)的藥物中，只有4 種提取物8-O-β-D-葡萄糖大黃素、青蒿素、皂苷和連翹苷在HBV DNA 釋放上表現(xiàn)出強烈的抑制作用。而除了前兩種，后兩種藥物在抑制HBeAg 和HBsAg 分泌上無明顯效應。此外，鞣花酸能有效地減少HBeAg分泌水平，而對HBV DNA 復制沒有抑制作用。因此，建議中草藥體外抗HBV 效應的研究應包括HBV DNA 定量檢測。

在體內(nèi)外實驗中證實有抗HBV 效應的單味中藥提取物中，乙醇提取物有8 種，水提取物有7 種，而正丁醇、甲醇和乙酸乙酯提取物各有1 種，此外均為分子構象明確的化合物，如大黃中提取的8-O-β-D-葡萄糖苷大黃素和黃芩中提取的漢黃芩素等，屬于酮類、苷類或蒽醌類物質(zhì)。而這兩種物質(zhì)在對體內(nèi)HBV DNA、HBeAg 和HBsAg 的釋放均具有較高的治療指數(shù)。體內(nèi)研究也表明，二者可明顯地降低感染鴨血漿中的DNA 水平。而苦參中提取的苦參堿若采用脂質(zhì)體包裹的方法進行改造，其抑制HBsAg 分泌和體內(nèi)DHBV 合成的效應都會增加［24］。以上結果提示不同的中藥提取方法和成分組成對其抗HBV 的活性也有影響。

所有的納入文獻中均未明確提及單味中藥提取物抗HBV 合成和分泌HBeAg 和HBsAg 的作用機制及作用途徑。但有動物實驗顯示用西藥拉米夫定治療感染鴨模型，其血清中DHBV DNA 會反常性升高，而大多數(shù)中藥提取物在終止治療后抗HBV 活性效應會持續(xù)存在。這大概與e 抗原和表面抗原參與了乙肝病毒的免疫應答［25］有關。提示中草藥制劑不僅具有直接抗HBV 功能，也可以通過抑制乙肝病毒抗原來調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)。

4 結論

越來越多的研究報道顯示，單味中藥提取物及提取物合成的化合物在體外實驗中顯示出較低的細胞毒性作用和抑制HBV DNA 合成及HBeAg 和HBsAg 分泌的作用，體內(nèi)實驗中也具有抗DHBV 活性的作用。其中丹參、大黃、苦參和黃芩這4 種草藥中提取出來的物質(zhì)和提取物組成的混合物的體內(nèi)外抗HBV 活性均已被證實，其在臨床試驗中的頻繁使用表明，它們在抗乙型肝炎病毒感染的治療上具有廣泛的治療價值。尤其是大黃中提取的8-O-β-D-葡萄糖苷大黃素和黃芩中提取的漢黃芩素，很可能成為抗HBV 新藥的候選者。本文通過對單味中藥體內(nèi)外抗HBV 活性的實驗進行檢索和分析，以期提供更多關于探索和評價中草藥治療慢性乙型肝炎的效果以及中草藥對抗HBV 新視角的信息。

［1］ Trépo C，Chan H L，Lok A. Hepatitis B virus infection［J］.Lancet，2014，384(9959):2053-2063.

［2］ Chen D S. Toward elimination and eradication of hepatitis B［J］. J Gastroenterol Hepatol，2010，25(1):19-25.

［3］ Aziz S，Rajper J，Noor-ul-Ain W，et al. Interferon-alpha treatment of children and young adults with chronic hepatitis delta virus (HDV)infection［J］. J Coll Physicians Surg Pak，2011，21(12):735-740.

［4］ Ze E，Baek E K，Lee J J，et al. Long-term outcomes of two rescue therapies in lamivudine-refractory patients with chronic hepatitis B:combined lamivudine and adefovir，and 1-mg entecavir［J］. Clin Mol Hepatol，2014，20(3):267-273.

［5］ Zhang L，Wang G，Hou W，et al. Contemporary clinical research of traditional Chinese medicines for chronic hepatitis B in China:an analytical review［J］. Hepatology，2010，51(2):690-698.

［6］ Chen Y，Zhu J. Anti-HBV effect of individual traditional Chinese herbal medicine in vitro and in vivo:an analytic review［J］. J Viral Hepa，2013，20(7):445-452.

［7］ Qi F H，Wang Z X，Cai P P，et al. Traditional Chinese medicine and related active compounds:a review of their role on hepatitis B virus infection［J］. Drug Discov Ther，2013，7(6):212-224.

［8］ Li Z，Li L J，Sun Y，et al. Identification of natural compounds with anti-hepatitis B virus activity from Rheum palmatum L ethanol extract［J］. Chemotherapy，2007，53(5):320-326.

［9］ 孫 燕，李 晶，李 治. 蒽醌對HBV 穩(wěn)定產(chǎn)毒細胞株HepAD38 HBV DNA 復制的抑制作用［J］. 中國組織化學與細胞化學雜志，2008，17(1):9-13.

［10］ Chang J S，Liu H W，Wang K C，et al. Ethanol extract of Polygonum cuspidatum inhibits hepatitis B virus in a stable HBVproducing cell line［J］. Antiviral Res，2005，66(1):29-34.

［11］ Guo Q，Zhao L，You Q et al. Anti-hepatitis B virus activity of wogonin in vitro and in vivo［J］. Antiviral Res，2007，74(1):16-24.

［12］ Huang R L，Chen C C，Huang H L，et al. Anti-hepatitis B virus effects of wogonin isolated from Scutellaria baicalensis［J］. Planta Med，2000，66(8):694-698.

［13］ Shin M S，Kang E H，Lee Y I. A flavonoid from medicinal plants blocks hepatitis B virus-e antigen secretion in HBV-infected hepatocytes［J］. Antiviral Res，2005，67(3):163-168.

［14］ 沈海容，劉 妮，張奉學，等. 紅背葉根不同提取物體外抑制HBsAg 和HBeAg 的實驗研究［J］. 中藥新藥與臨床藥理，2014，25(1):39-43.

［15］ Li C Q，Zhu Y T，Zhang F X，et al. Anti-HBV effect of liposome-encapsulated matrine in vitro and in vivo［J］. World J Gastroenterol，2005，11(3):426-428.

［16］ 張奉學，汪曉軍，劉 妮，等. 黃芩甙對HBsAg 和HBeAg的體外抑制作用［J］. 中西醫(yī)結合肝病雜志，2003，13(5):267-269.

［17］ 趙志鴻，侯迎迎，鄭立運，等. 艾葉乙酸乙酯提取物對HBV 的抑制作用［J］. 鄭州大學學報:醫(yī)學版，2013，48(6):783-785.

［18］ 竇志芳，馮前進，何金洋. 苦味葉下珠總多酚-殼聚糖復合物抗鴨乙肝病毒的作用研究［J］. 中藥藥理與臨床，2007，23(3):39-40.

［19］ 韓 林，梁睿敏，劉 斌. 苦味葉下珠不同制劑對鴨體內(nèi)乙肝病毒的抑制作用［J］. 中草藥，2006，37(6):910-912.

［20］ 黃權芳，楊 輝，韋 剛，等. 山芝麻抗鴨乙型肝炎病毒作用［J］. 中國實驗方劑學雜志，2011，17(20):179-181.

［21］ 林 興，黃權芳，張士軍，等. 山芝麻抗鴨體內(nèi)乙肝病毒及保肝作用的實驗研究［J］. 華西藥學雜志，2012，27(2):134-137.

［22］ Zhou Z，Zhang Y，Ding X R，et al. Protocatechuic aldehyde inhibits hepatitis B virus replication both in vitro and in vivo［J］.Antiviral Res，2007，74(1):59-64.

［23］ 林 青，付美麗，劉小朋，等. 青蒿琥酯抗鴨乙型肝炎病毒的體內(nèi)實驗［J］. 國際流行病學傳染病學雜志，2006，33(5):308-310.

［24］ Li C Q，Zhu Y T，Zhang F X，et al. Anti-HBV effect of liposome-encapsulated matrine in vitro and in vivo［J］. World J Gastroenterol，2005，11(3):426-428.

［25］ Bertoletti A，Gehring A J. The immune response during hepatitis B virus infection［J］. J Gen Virol，2006，87(4):1439-1449.