房海靈， 聶 韡， 盧艷花， 朱培林*

(1. 江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌330032;2. 華東理工大學(xué)，上海200237)

廣東紫珠Callicarpa kwangtungensis Chun. 為馬鞭草科紫珠屬多年生落葉灌木植物［1］，以干燥莖枝和葉入藥，在我國用藥歷史相對較短，以“萬年青”之名始載于清代《植物名實圖考》［2］，被《中國藥典》2010 年版收載［3］，具有收斂止血、散瘀、清熱解毒之功效，臨床上常用于治療宮頸糜爛出血、陰道炎、宮頸炎等癥［4］。研究表明，廣東紫珠的主要化學(xué)成分為黃酮、苯乙醇苷、萜類及揮發(fā)油等［5-8］，其中三萜類化合物(如熊果酸、齊墩果酸等)具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化和降血糖等藥理作用［9］，屬于活性物質(zhì)，與該植物的主要功效相符，因而有必要對其進行質(zhì)量控制。目前，國內(nèi)對該藥材質(zhì)量的研究主要集中在苯乙醇苷類化合物含有量的測定方面［10-11］，鮮有三萜類化合物測定的相關(guān)報道［12］。本實驗采用HPLC 法，對不同產(chǎn)地、采收期、部位廣東紫珠中熊果酸和齊墩果酸的含有量進行測定，為全面控制其質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Waters 2695 HPLC 色譜儀，包括真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、Waters 2468 紫外光檢測器、Empower 色譜工作站(美國Waters 公司)。熊果酸(批號110742-200518，純度95%)、齊墩果酸(批號110709-200505，純度95%)對照品(中國食品藥品檢定研究院)。各批次藥材經(jīng)江西省林業(yè)科學(xué)院森林藥材與食品研究所朱培林研究員鑒定，均為廣東紫珠C. kwangtungensis 的地上部分。甲醇為色譜純(德國Merck 公司);水為超純水(自制);其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ZOBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(90∶10);體積流量1 mL/min;檢測波長210 nm;柱溫25 ℃;進樣量20 μL。理論塔板數(shù)按熊果酸峰計算，不低于5 000。在此色譜條件下，樣品中熊果酸和齊墩果酸能達到基線分離，見圖1。

圖1 對照品和供試品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.2 樣品制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取熊果酸、齊墩果酸對照品適量，加甲醇溶解，制成對照品母液。再分別吸取母液適量，置于同一量瓶中，加甲醇定容，得到質(zhì)量濃度分別為52.40、55.36 μg/mL的混合對照品溶液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的廣東紫珠粉末(過100 目篩)1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入乙醇40 mL，稱定質(zhì)量，冷浸4 h，超聲(150 W、40 kHz)40 min，放冷，乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻。過濾后，藥渣按相同方法重復(fù)提取2 次，合并濾液，濃縮，乙醇定容至40 mL，0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液1、4、8、16、20 μL，在“2.1”項色譜條件下測定，以進樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進行線性回歸，得到熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y =436 428X -18 545 (r =0.999 8);齊墩果酸為Y =469 748X -18 730 (r =0.999 8)。結(jié)果表明，兩者分別在0.052 4 ～1.048、0.055 ～1.107 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液20 μL，重復(fù)進樣5 次，在“2.1”項色譜條件下測定各對照品峰面積。結(jié)果，熊果酸、齊墩果酸峰面積RSD (n=5)分別為0.3%、0.6%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗 精密稱取江西井岡山產(chǎn)廣東紫珠粉末5 份，每份1.0 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL 進樣，測定峰面積。結(jié)果，熊果酸、齊墩果酸峰面積RSD 分別為0.8%、0.9%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取江西井岡山產(chǎn)廣東紫珠粉末1.0 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣，測定峰面積。結(jié)果，熊果酸、齊墩果酸峰面積RSD 分別為0.8%、0.7%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗 分別稱取各成分含有量已知的江西井岡山產(chǎn)廣東紫珠粉末5 份，每份0.5 g，精密加入含熊果酸0.43 mg、齊墩果酸0.265 mg 的乙醇溶液40 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定峰面積，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果Tab.1 Result of recovery tests

2.8 樣品測定 分別取不同產(chǎn)地、采收期、部位的廣東紫珠粉末適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL，注入HPLC 色譜儀，在“2.1”項色譜條件下進樣分析，測定峰面積，用外標(biāo)法進行計算，結(jié)果見表2 ～4。

3 討論

本實驗考察了不同提取溶劑 (45%、70%、100%乙醇，50%、100% 甲醇)以及水浴回流、索氏、超聲等不同提取方法，發(fā)現(xiàn)乙醇提取的效果最佳。同時，還考察了以乙醇為提取溶劑，在不同提取時間 (40、50、60 min)、料液比 (1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50)、溫度 (50、60、70 ℃)、次數(shù)(1、2、3 次)時的提取效果。結(jié)果表明，以乙醇為提取溶劑、料液比1 ∶40、在60 ℃下超聲40 min、提取兩次時，提取較完全，而且該方法穩(wěn)定、重復(fù)性好。

在流動相系統(tǒng)的選擇方面，張光賢［15］報道了采用HPLC 法(流動相為甲醇-1.0% 冰醋酸水溶液)進行定量測定，但分離度不理想。本實驗考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液這3 個系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相時，所得色譜峰峰形較好，分離效果最佳。同時，還考察了該流動相的3 個比例(95 ∶5、90 ∶10、82 ∶18)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)其比例為90 ∶10時，在20 min 內(nèi)出峰，保留時間合適，分離效果理想。因此，選擇甲醇-0.1% 磷酸水溶液(90 ∶10)作為流動相。

表2 不同產(chǎn)地廣東紫珠的測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Determination result of C.kwangtungensis from different growing areas (n=3)

表3 不同采收期廣東紫珠的測定結(jié)果(n=3)Tab.3 Determination result of C. kwangtungensis in different picking times (n=3)

表4 廣東紫珠不同部位的測定結(jié)果(n=3)Tab.4 Determination result of C. kwangtungensis in different parts (n=3)

熊果酸與齊墩果酸為同分異構(gòu)體，在天然植物中往往共生互存，結(jié)構(gòu)與性質(zhì)極其相似，故分離測定較為困難。早期研究采用薄層掃描色譜法測定［13］，但是易受操作環(huán)境及手法等因素影響，導(dǎo)致定量分析結(jié)果有所偏差。為此，本實驗在文獻［12，14-15］的基礎(chǔ)上，結(jié)合實際情況，建立了同時測定廣東紫珠中熊果酸和齊墩果酸含有量的方法，為系統(tǒng)評價該植物的質(zhì)量提供理論依據(jù)。通過對17 個產(chǎn)地藥材中這兩種成分含有量的分析，發(fā)現(xiàn)均以熊果酸為高，約為齊墩果酸的1.5 ～2.5 倍，相差較大。因此，應(yīng)注意提高藥材內(nèi)在性質(zhì)的穩(wěn)定性，保證臨床用藥的安全性和有效性。

同時，本實驗還測定了江西蘆溪6 月至11 月廣東紫珠中熊果酸和齊墩果酸的含有量。結(jié)果表明，在該植物生長發(fā)育的不同階段，兩者存在顯著性差異，其含有量的動態(tài)積累存在一個由高到低的趨勢，并且在9 月份最高。另外，又比較了該藥材不同部位中兩者的含有量，發(fā)現(xiàn)在果實中最高，而在根中最低。因此，該方法可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中，并根據(jù)不同的生產(chǎn)目的對植物原料進行采收，具有重要的現(xiàn)實意義和參考價值。

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