HPLC 法同時測定二丁顆粒中的單咖啡?；剖帷⑶仄ひ宜睾途哲乃?/h1>
2015-01-13 09:18:18黎田兒黃文平何明珍楊世林張武崗馮育林王永林
中成藥 2015年10期
占 遠， 黎田兒， 黃文平， 簡 輝， 李 艷， 何明珍， 楊世林，* ， 張武崗* ，馮育林， 王永林
(1. 貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽550004;2. 中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌330006;3. 江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌330004)
二丁顆粒是《中國藥典》2010 年版收載的常用中成藥，具有清熱解毒的功效，用于治療火熱毒盛所致的熱癤癰毒、咽喉腫痛、風熱火眼，臨床可用于治療急性咽炎、急性支氣管炎等［1-4］，該藥物主要由紫花地丁、蒲公英、板藍根和半邊蓮組成。其中，蒲公英的主要成分單咖啡酰基酒石酸和菊苣酸具有增強人體免疫、抗炎、抗氧化作用［5-7］，目前《中國藥典》2010 年版僅以秦皮乙素這一種成分來衡量二丁顆粒的質(zhì)量，具有一定局限性。因此，基于單咖啡?；剖岷途哲乃岬乃幚砘钚裕緦嶒灢捎酶咝б合嗌V(HPLC)法同時測定二丁顆粒中單咖啡?；剖?、秦皮乙素和菊苣酸這3 種成分的含有量，以期為該藥物的進一步研究奠定基礎，同時為其質(zhì)量控制提供科學依據(jù)，用于保證臨床安全用藥。
1 儀器與試藥
1.1 儀器 島津LC-20ADXR HPLC 色譜儀，包括可變波長紫外檢測器(PDA)、島津工作站(日本島津公司);Millipore Simplicity 超純水器 (美國Millipore 公司);AUW220D 電子分析天平(上海天平儀器廠);AB135-S 電子天平(十萬分之一，瑞士Mettler Toledo 公司)。
1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck 公司);水為超純水;其他試劑均為分析純。
1.3 對照品 單咖啡?；剖釋φ掌?批號D75-20141017，中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心);秦皮乙素對照品 (批號 110741-200506)、菊苣酸對照品 (批號111752-200902)(中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%)。
1.4 樣品 二丁顆粒 (批號分別為140201、140202、140203、140204、140301、140302、140303、140304、140305、140501、140502、140503、140504、140505、140506)。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件 COSMOSIL C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0.01 ～2 min，2% A;2 ～3 min，2% ～15% A;3 ～25 min，15% ～24%A)。體積流量1 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長336 nm。在此條件下，單咖啡?；剖?、秦皮乙素、菊苣酸與其他組分均有較好的分離，理論塔板數(shù)按各峰計算，均不低于2 000。
2.2 對照品溶液的制備 精密稱取各對照品適量，置于50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得對照品儲備液。然后，取貯備液適量加以稀釋，制成單咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸質(zhì)量濃度分別為0.004 1、0.061 3、0.005 6 mg/mL 的混合對照品溶液，即得。
2.3 供試品溶液的制備 精密稱取二丁顆粒粉末0.3 g，置于具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min (300 W、40 kHz)，放冷，70%甲醇補足減失的質(zhì)量，過0.45 μm 濾膜，取續(xù)濾液，即得。
2.4 陰性樣品溶液的制備 按二丁顆粒的處方比例稱取缺紫花地丁、缺蒲公英、缺紫花地丁和蒲公英的其他藥味各一份，根據(jù)其生產(chǎn)工藝，分別制成紫花地丁、蒲公英、紫花地丁和蒲公英空白樣品，按“2.3”項下方法制備陰性樣品溶液，即得。
2.5 系統(tǒng)專屬性試驗 分別吸取混合對照品、供試品和陰性樣品溶液20 μL，注入HPLC 色譜儀，在“2.1”項色譜條件下分析。結(jié)果，供試品在與對照品色譜圖的相同保留時間處有色譜峰，而陰性樣品則無相應峰出現(xiàn)，表明處方中其他成分對三者的測定無干擾，見圖1。
2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液適量，注入HPLC 色譜儀，在“2.1”項色譜條件下進樣分析，測定對照品峰面積。然后，以峰面積為縱坐標(y)，進樣量(μL)為橫坐標(x)進行回歸計算，得到線性方程，發(fā)現(xiàn)均呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表1。
表1 線性回歸方程Tab.1 Linear regression equations
2.7 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液4 μL，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6 次分析，測定色譜峰面積。結(jié)果，計算出單咖啡?；剖?、秦皮乙素和菊苣酸的RSD 分別為1.2%、0.21%、0.82%，表明儀器精密度良好。
2.8 穩(wěn)定性試驗 分別精密吸取同一供試品(批號140503)溶液適量，在“2.1”項色譜條件下分別于0、1、2、5、8、12 h 進樣20 μL 分析，測定色譜峰面積。結(jié)果，計算出單咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸的RSD 分別為1.7%、1.7% 和1.8%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
圖1 專屬性HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC specific chromatograms
2.9 重復性試驗 取同一批樣品(批號140503)適量，按“2.3”項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣20 μL 分析。結(jié)果，計算出單咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸的RSD 分別為1.0%、0.79%和1.3%，表明該方法重復性良好。
2.10 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的樣品(批號140503)0.3 g，共6 份，按其含各成分80%、100%、120%的量，分別加入單咖啡?；剖?2.6 μg/mL)5.5、6.6、8.3 mL，秦皮乙素(319 μg/mL)0.669、0.784、0.992 mL，菊苣酸(2.1 μg/mL)對照品溶液3.9、4.5、5.8 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣20 μL 分析，結(jié)果見表2，表明該方法回收率良好。
表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab.2 Result of recovery tests (n=6)
2.11 檢測限與定量限 在“2.1”項色譜條件下，分別精密量取單咖啡?；剖岷途哲乃釋φ掌愤m量，逐級稀釋進樣。最終，確定兩者的檢測限分別為1.4 和2.2 ng (S/N =3)，定量限分別為8.12 和12.2 ng (S/N ＞10)。
2.12 樣品測定 取15 批二丁顆粒，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進行測定，記錄峰面積。然后，以回歸方程計算單咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸的含有量，結(jié)果見表3。
表3 樣品測定結(jié)果(n=4)Tab.3 Result of determination of samples (n=4)
3 討論與小結(jié)
3.1 提取條件的選擇 本實驗采用單因素變量法，分別對提取方法(冷浸、超聲、回流)、提取溶劑(甲醇、乙醇、水)、溶劑比例 (30%、50%、70%甲醇)、提取時間(30、60、120 min)等因素進行考察。結(jié)果顯示，回流和超聲的提取效果優(yōu)于冷浸，但超聲操作更為簡便，故選擇超聲提取方式;甲醇和水的提取效果明顯優(yōu)于乙醇，而且當甲醇體積分數(shù)為70%時最佳;超聲30 min 后，隨著超聲時間進一步增加，各成分溶出的程度不再明顯增加，故選擇提取30 min。最終，確定提取方法為70%甲醇超聲提取30 min。
3.2 流動相及檢測波長的選擇 根據(jù)文獻［8-12］，本實驗比較了甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液這兩種流動相，發(fā)現(xiàn)后者的分離效果更好，故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相。另外，經(jīng)HPLC 全波長掃描發(fā)現(xiàn)，單咖啡?；剖?、秦皮乙素和菊苣酸的最大吸收波長分別為328、345 和331 nm，由于三者在336 nm 波長下均有較強的吸收，可同時被檢測出，故選擇336 nm作為檢測波長。
［1］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:410
［2］ 賈紅慧，袁 潔，勾 倞，等. 二丁顆粒的抑菌抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用［J］. 華西藥學雜志，2006，21(5):453-456.
［3］ 何世祺. 阿奇霉素聯(lián)合二丁顆粒治療痤瘡［J］. 中國醫(yī)藥指南，2013，11(12):213-214.
［4］ 張國銀. 二丁顆粒治療慢性支氣管炎療效觀察［J］. 河北中醫(yī)，2011，33(6):911-912.
［5］ Villano D，F(xiàn)ernández-Pachón M S，Moyá M L，et al. Radical scavenging ability of polyphenolic compounds towards DPPH free radical［J］. Talanta，2007，71(1):230-235.
［6］ 李 斌，魏超田，勞 揚，等. 三種菊科植物抗癌抗炎組分分離與功能研究［J］. 現(xiàn)代食品科技，2013，29(7):1620-1626.
［7］ Khaksary Mahabady M，Ranjbar R，Arzi A，et al. A comparison study of effects of Echinacea extract and levamisole on phenytoin-induced cleft palate in mice［J］. Regul Toxicol Pharmacol，2006，46(3):163-166.
［8］ 鄧曉鴻，董 林，李 毅. HPLC 測定二丁顆粒中秦皮乙素的含量［J］. 華西藥學雜志，2003，18(6):452-454.
［9］ 劉 睿，孫 璐，趙 雯，等. HPLC 同時測定苦碟子注射液中單咖啡酰基酒石酸、咖啡酸、綠原酸、阿魏酸、菊苣酸的含量［J］. 中國中藥雜志，2013，28 (19):3287-3290.
［10］ 李 越，安開龍，李德坤，等. HPLC-UV 法測定五味子中5-羥甲基糠醛［J］. 中成藥，2015，31(1):141-144.
［11］ 崔 玲，何云飛，徐燦輝. HPLC 法同時測定婦炎凈片中4種成分［J］. 中成藥，2014，36(6):1199-1202.
［12］ 韓琳娜，孫俊英，郭慶梅. 引種紫錐菊不同部位有效成分含量的動態(tài)測定［J］. 世界科學技術(shù):中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014，16(8):1858-1861.
占 遠， 黎田兒， 黃文平， 簡 輝， 李 艷， 何明珍， 楊世林，* ， 張武崗* ，馮育林， 王永林
(1. 貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽550004;2. 中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌330006;3. 江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌330004)
二丁顆粒是《中國藥典》2010 年版收載的常用中成藥，具有清熱解毒的功效，用于治療火熱毒盛所致的熱癤癰毒、咽喉腫痛、風熱火眼，臨床可用于治療急性咽炎、急性支氣管炎等［1-4］，該藥物主要由紫花地丁、蒲公英、板藍根和半邊蓮組成。其中，蒲公英的主要成分單咖啡酰基酒石酸和菊苣酸具有增強人體免疫、抗炎、抗氧化作用［5-7］，目前《中國藥典》2010 年版僅以秦皮乙素這一種成分來衡量二丁顆粒的質(zhì)量，具有一定局限性。因此，基于單咖啡?；剖岷途哲乃岬乃幚砘钚裕緦嶒灢捎酶咝б合嗌V(HPLC)法同時測定二丁顆粒中單咖啡?；剖?、秦皮乙素和菊苣酸這3 種成分的含有量，以期為該藥物的進一步研究奠定基礎，同時為其質(zhì)量控制提供科學依據(jù)，用于保證臨床安全用藥。
1 儀器與試藥
1.1 儀器 島津LC-20ADXR HPLC 色譜儀，包括可變波長紫外檢測器(PDA)、島津工作站(日本島津公司);Millipore Simplicity 超純水器 (美國Millipore 公司);AUW220D 電子分析天平(上海天平儀器廠);AB135-S 電子天平(十萬分之一，瑞士Mettler Toledo 公司)。
1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck 公司);水為超純水;其他試劑均為分析純。
1.3 對照品 單咖啡?；剖釋φ掌?批號D75-20141017，中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心);秦皮乙素對照品 (批號 110741-200506)、菊苣酸對照品 (批號111752-200902)(中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%)。
1.4 樣品 二丁顆粒 (批號分別為140201、140202、140203、140204、140301、140302、140303、140304、140305、140501、140502、140503、140504、140505、140506)。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件 COSMOSIL C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0.01 ～2 min，2% A;2 ～3 min，2% ～15% A;3 ～25 min，15% ～24%A)。體積流量1 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長336 nm。在此條件下，單咖啡?；剖?、秦皮乙素、菊苣酸與其他組分均有較好的分離，理論塔板數(shù)按各峰計算，均不低于2 000。
2.2 對照品溶液的制備 精密稱取各對照品適量，置于50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得對照品儲備液。然后，取貯備液適量加以稀釋，制成單咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸質(zhì)量濃度分別為0.004 1、0.061 3、0.005 6 mg/mL 的混合對照品溶液，即得。
2.3 供試品溶液的制備 精密稱取二丁顆粒粉末0.3 g，置于具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min (300 W、40 kHz)，放冷，70%甲醇補足減失的質(zhì)量，過0.45 μm 濾膜，取續(xù)濾液，即得。
2.4 陰性樣品溶液的制備 按二丁顆粒的處方比例稱取缺紫花地丁、缺蒲公英、缺紫花地丁和蒲公英的其他藥味各一份，根據(jù)其生產(chǎn)工藝，分別制成紫花地丁、蒲公英、紫花地丁和蒲公英空白樣品，按“2.3”項下方法制備陰性樣品溶液，即得。
2.5 系統(tǒng)專屬性試驗 分別吸取混合對照品、供試品和陰性樣品溶液20 μL，注入HPLC 色譜儀，在“2.1”項色譜條件下分析。結(jié)果，供試品在與對照品色譜圖的相同保留時間處有色譜峰，而陰性樣品則無相應峰出現(xiàn)，表明處方中其他成分對三者的測定無干擾，見圖1。
2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液適量，注入HPLC 色譜儀，在“2.1”項色譜條件下進樣分析，測定對照品峰面積。然后，以峰面積為縱坐標(y)，進樣量(μL)為橫坐標(x)進行回歸計算，得到線性方程，發(fā)現(xiàn)均呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表1。
表1 線性回歸方程Tab.1 Linear regression equations
2.7 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液4 μL，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6 次分析，測定色譜峰面積。結(jié)果，計算出單咖啡?；剖?、秦皮乙素和菊苣酸的RSD 分別為1.2%、0.21%、0.82%，表明儀器精密度良好。
2.8 穩(wěn)定性試驗 分別精密吸取同一供試品(批號140503)溶液適量，在“2.1”項色譜條件下分別于0、1、2、5、8、12 h 進樣20 μL 分析，測定色譜峰面積。結(jié)果，計算出單咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸的RSD 分別為1.7%、1.7% 和1.8%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
圖1 專屬性HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC specific chromatograms
2.9 重復性試驗 取同一批樣品(批號140503)適量，按“2.3”項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣20 μL 分析。結(jié)果，計算出單咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸的RSD 分別為1.0%、0.79%和1.3%，表明該方法重復性良好。
2.10 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的樣品(批號140503)0.3 g，共6 份，按其含各成分80%、100%、120%的量，分別加入單咖啡?；剖?2.6 μg/mL)5.5、6.6、8.3 mL，秦皮乙素(319 μg/mL)0.669、0.784、0.992 mL，菊苣酸(2.1 μg/mL)對照品溶液3.9、4.5、5.8 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣20 μL 分析，結(jié)果見表2，表明該方法回收率良好。
表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab.2 Result of recovery tests (n=6)
2.11 檢測限與定量限 在“2.1”項色譜條件下，分別精密量取單咖啡?；剖岷途哲乃釋φ掌愤m量，逐級稀釋進樣。最終，確定兩者的檢測限分別為1.4 和2.2 ng (S/N =3)，定量限分別為8.12 和12.2 ng (S/N ＞10)。
2.12 樣品測定 取15 批二丁顆粒，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進行測定，記錄峰面積。然后，以回歸方程計算單咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸的含有量，結(jié)果見表3。
表3 樣品測定結(jié)果(n=4)Tab.3 Result of determination of samples (n=4)
3 討論與小結(jié)
3.1 提取條件的選擇 本實驗采用單因素變量法，分別對提取方法(冷浸、超聲、回流)、提取溶劑(甲醇、乙醇、水)、溶劑比例 (30%、50%、70%甲醇)、提取時間(30、60、120 min)等因素進行考察。結(jié)果顯示，回流和超聲的提取效果優(yōu)于冷浸，但超聲操作更為簡便，故選擇超聲提取方式;甲醇和水的提取效果明顯優(yōu)于乙醇，而且當甲醇體積分數(shù)為70%時最佳;超聲30 min 后，隨著超聲時間進一步增加，各成分溶出的程度不再明顯增加，故選擇提取30 min。最終，確定提取方法為70%甲醇超聲提取30 min。
3.2 流動相及檢測波長的選擇 根據(jù)文獻［8-12］，本實驗比較了甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液這兩種流動相，發(fā)現(xiàn)后者的分離效果更好，故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相。另外，經(jīng)HPLC 全波長掃描發(fā)現(xiàn)，單咖啡?；剖?、秦皮乙素和菊苣酸的最大吸收波長分別為328、345 和331 nm，由于三者在336 nm 波長下均有較強的吸收，可同時被檢測出，故選擇336 nm作為檢測波長。
［1］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:410
［2］ 賈紅慧，袁 潔，勾 倞，等. 二丁顆粒的抑菌抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用［J］. 華西藥學雜志，2006，21(5):453-456.
［3］ 何世祺. 阿奇霉素聯(lián)合二丁顆粒治療痤瘡［J］. 中國醫(yī)藥指南，2013，11(12):213-214.
［4］ 張國銀. 二丁顆粒治療慢性支氣管炎療效觀察［J］. 河北中醫(yī)，2011，33(6):911-912.
［5］ Villano D，F(xiàn)ernández-Pachón M S，Moyá M L，et al. Radical scavenging ability of polyphenolic compounds towards DPPH free radical［J］. Talanta，2007，71(1):230-235.
［6］ 李 斌，魏超田，勞 揚，等. 三種菊科植物抗癌抗炎組分分離與功能研究［J］. 現(xiàn)代食品科技，2013，29(7):1620-1626.
［7］ Khaksary Mahabady M，Ranjbar R，Arzi A，et al. A comparison study of effects of Echinacea extract and levamisole on phenytoin-induced cleft palate in mice［J］. Regul Toxicol Pharmacol，2006，46(3):163-166.
［8］ 鄧曉鴻，董 林，李 毅. HPLC 測定二丁顆粒中秦皮乙素的含量［J］. 華西藥學雜志，2003，18(6):452-454.
［9］ 劉 睿，孫 璐，趙 雯，等. HPLC 同時測定苦碟子注射液中單咖啡酰基酒石酸、咖啡酸、綠原酸、阿魏酸、菊苣酸的含量［J］. 中國中藥雜志，2013，28 (19):3287-3290.
［10］ 李 越，安開龍，李德坤，等. HPLC-UV 法測定五味子中5-羥甲基糠醛［J］. 中成藥，2015，31(1):141-144.
［11］ 崔 玲，何云飛，徐燦輝. HPLC 法同時測定婦炎凈片中4種成分［J］. 中成藥，2014，36(6):1199-1202.
［12］ 韓琳娜，孫俊英，郭慶梅. 引種紫錐菊不同部位有效成分含量的動態(tài)測定［J］. 世界科學技術(shù):中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014，16(8):1858-1861.
