馮素香， 史晶晶， 吳兆宇， 周悌強(qiáng)， 李建生， 王蒙蒙， 郝 蕊， 李 先

(河南中醫(yī)學(xué)院呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450046)

三七(Notoginseng Radix et Rhizoma)為五加科植物三七的干燥根和莖，又名田七、金不換等，是我國(guó)名貴的傳統(tǒng)中藥。其性溫，味甘、微苦，歸肝、胃經(jīng)，含皂苷、多糖等有效成分，有散瘀止血、消腫定痛之功效，用于治療咯血、崩漏、外傷出血、胸腹刺痛、跌撲腫痛等［1］，其中三七皂苷是主要有效成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，該成分能改善腦缺血后腦組織的能量代謝［2］、抗帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病、抗腎間質(zhì)纖維化［3］、抗糖尿病腎病，抗腎小球纖維化等泌尿系統(tǒng)疾病、抗肝纖維化等作用［4］。目前，三七的提取方法有滲漉法［5］、醇回流提取法、超聲提取法［6］等，而最近又有閃式提取法對(duì)三七有效成分進(jìn)行研究的報(bào)道［7-8］，但尚未將該方法應(yīng)用于三七總皂苷。閃式提取法是一種在常溫下快速提取的方法，具有高效、節(jié)能等特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)以三七提取物中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 這五種皂苷含有量的總和作為總皂苷含有量，以三七提取物的出膏率和總皂苷含有量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)該方法進(jìn)行優(yōu)化，用以探討不同提取方法對(duì)三七總皂苷提取率的影響，為其提取提供新方法。

1 材料

JHBE-50 閃式提取器(河南金鼎科技發(fā)展有限公司);Waters e2695 HPLC 色譜儀，包括Waters 2998 紫外檢測(cè)器、Empower 色譜工作站 (美國(guó)Water 公司);KH2200DB 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);XS105 電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);SHE-D (III)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

三七皂苷R1(批號(hào)110745-200617)、人參皂苷Rg1(批號(hào)110703-201128)、人參皂苷Re (批號(hào)110754-200421)、人參皂苷Rb1(批號(hào)110704-201223)、人參皂苷Rd (批號(hào)111818-201001)對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)。乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher 公司);水為超純水(自制)。三七飲片購(gòu)自河南張仲景大藥房股份有限公司，由河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院陳隨清教授鑒定為五加科植物三七Panax notoginseng (Burk.)F. H. Chen 的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 三七提取物中總皂苷的HPLC 測(cè)定

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱取三七提取物20 mg，置10 mL 量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2 色譜條件 Venusil XBP-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫0 →12 min→60 min→70 min，81%A →81% A →64% A →81% A［1］;檢 測(cè) 波 長(zhǎng)203 nm;進(jìn)樣量10 μL;柱溫25 ℃，三七混合對(duì)照品及供試品色譜圖見圖1。

圖1 HPLC 色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd 對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為 0.174、0.512、0.105、0.446、0.151 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液。然后，精密量取0.5、1、2、4、5、10 mL，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度線，搖勻。在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各組分的回歸方程，見表1。

表1 各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.1 Standard curves of various constituents

2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6 次進(jìn)行測(cè)定，每次10 μL，記錄峰面積RSD。結(jié)果，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd 的RSD 值分別為1.31%、1.54%、1.29%、1.63%和1.40%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下同一對(duì)照品溶液適量，分別于配制后0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積RSD。結(jié)果，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 的RSD 值分別為1.61%、1.53%、1.39%、1.86%和1.09%，說明對(duì)照品溶液在常溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取提取物6 份，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。結(jié)果，以上5 種皂苷含有量的RSD 值分別為1.41%、0.94%、1.76%、1.35%和1.83%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取三七皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)已知的提取物樣品6 份，每份10 mg，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 的質(zhì)量濃度分別為0.569、2.947、0.432、1.925、0.711 mg/mL)1 mL，加甲醇溶解，定容于10 mL 量瓶中，制備供試品溶液，并在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。結(jié)果，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 的平均加樣回收率分別為100.1%、98.7%、99.7%、98.9%、99.7%，RSD 值分別為1.89%、1.03%、0.89%、1.98%、1.02%，表明該方法回收率良好。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 稱取三七藥材粗粉適量，按L9(34)正交表，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、物料比(B)和提取時(shí)間(C)為考察因素，在120 V 電壓下進(jìn)行閃式提取，以三七總皂苷的含有量和出膏率為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平見表2。然后，再稱取三七藥材適量，在120 V 電壓下閃式提取2 次，合并濾液，濃縮至無(wú)醇味，用等體積石油醚萃取2 次，收集下層水液，水浴中揮去石油醚，水液用等體積水飽和正丁醇萃取數(shù)次，至正丁醇層無(wú)色，水浴中揮至無(wú)正丁醇味，冷凍干燥，即得三七總皂苷提取物。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

2.3 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果 根據(jù)L9(34)表安排實(shí)驗(yàn)，測(cè)定提取物中總皂苷的含有量和出膏率，以上述兩個(gè)指標(biāo)的綜合評(píng)分對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，見表3 和表4。設(shè)定滿分為100，權(quán)重系數(shù)分別為0.7和0.3，計(jì)算公式為綜合評(píng)分= (0.7 ×X/Xmax×100 +0.3 ×Y/Ymax) ×100%，其中X 為提取物中總皂苷含有量，Y 為出膏率［9-10］。由表4 可知，因素A 和B 對(duì)結(jié)果均有非常顯著的差異(P ＜0.01)，三個(gè)因素的影響大小順序是乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取時(shí)間。綜合以上分析結(jié)果，優(yōu)選出三七總皂苷的閃提最佳工藝是A2B3C1，即加12 倍量70%乙醇，閃式提取1 min。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 為驗(yàn)證正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)中最優(yōu)工藝的重復(fù)性和可靠性，用閃式提取最優(yōu)工藝提取三七，平行3 份，結(jié)果見表5，可見其可靠性和重復(fù)性良好。

2.5 兩種提取方法的比較 根據(jù)文獻(xiàn)［11-12］，設(shè)計(jì)乙醇回流提取三七總皂苷的最優(yōu)工藝，即70%乙醇回流提取兩次，每次2 h，物料比1 ∶10，結(jié)果見表6。由表可知，閃式提取法所得三七總皂苷的量遠(yuǎn)高于回流提取法，而且提取物的出膏率也略高于后者，表明閃式提取法提取總皂苷的量高于回流提取法。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and result of orthogonal experiment

表4 綜合評(píng)分方差分析Tab.4 Variance analysis of fingerprint

表5 閃式提取優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)Tab.5 Experiment verifying optimized smashing tissue extraction method

表6 閃式提取法和回流提取法的比較(±s，n=3)Tab.6 Comparison between smashing tissue extraction and reflux extraction method (±s，n=3)

表6 閃式提取法和回流提取法的比較(±s，n=3)Tab.6 Comparison between smashing tissue extraction and reflux extraction method (±s，n=3)

注:提取率= (總皂苷提取量/藥材中總皂苷量) ×100%

提取方法 乙醇/% 料液比 提取時(shí)間/min 總皂苷/ (mg·g -1) 提取率/% 出膏率/%70 1 ∶12 1 651.6 ±10.1 72.60 ±1.13 11.49 ±0.11回流提取閃式提取70 1 ∶10 120 567.3 ±8.4 63.21 ±0.94 11.93 ±0.22

3 討論

3.1 三七總皂苷提取工藝的比較 本實(shí)驗(yàn)采用閃式提取法，對(duì)三七提取物中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 進(jìn)行研究，得出最佳工藝，即加12 倍量70%乙醇，提取1 min。同時(shí)，與回流提取法進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)閃式提取法所得三七總皂苷的含有量高于回流提取法，而且提取效率較高。

3.2 流動(dòng)相的考察 本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同流動(dòng)相比例和梯度進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)以水 (A)-乙腈 (B)梯度洗脫(81%A→81%A→64%A→81%A，相應(yīng)時(shí)間周期為0→12 min→60 min→70 min)時(shí)，色譜峰的峰形及分離度均良好，而且保留時(shí)間適宜。

閃式提取法的主要原理是通過高速機(jī)械力對(duì)植物組織進(jìn)行破壞，使有效成分迅速溶出轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到有效成分快速提取的目的［13-14］。研究表明［15-16］，它較于回流提取等傳統(tǒng)方法，具有操作簡(jiǎn)便、快速高效等特點(diǎn)。而且，閃式提取法在室溫下操作，可避免高溫破壞有效成分，是一種可靠并有發(fā)展?jié)摿Φ奶崛〖夹g(shù)。

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