蘭繼平， 王雅琪 ， 黃麗琴， 汪 旋， 鄭 琴， 楊 明

(江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌330004)

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort 的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱解毒，涼血利咽之功效，為臨床常用的抗病毒中草藥［1］。近年來大量藥理研究表明，板藍(lán)根的抗病毒機(jī)制主要與其生物堿及核苷類成分密切相關(guān)，不僅具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、消炎抗菌等藥理活性［2-3］，而且作為廣譜抗病毒藥物，被用于SARS、流感等疫情的候選藥物，正日益受到重視，同時(shí)其抑制SARS 病毒的作用已被相關(guān)研究證實(shí)［4-5］。

紅細(xì)胞凝集反應(yīng)是紅細(xì)胞表面顆粒型凝集原與外源凝集素結(jié)合并凝集成團(tuán)的現(xiàn)象［6］，血紅細(xì)胞表面存在對(duì)各種病毒的受體，病毒與受體結(jié)合，以紅細(xì)胞為橋梁，從而引起凝集，如果存在抗病毒成分時(shí)，則由病毒所引起的凝集作用將被抑制，故利用此反應(yīng)可進(jìn)行抗病毒成分效價(jià)的檢測(cè)。大量文獻(xiàn)資料證實(shí)，紅細(xì)胞凝集活性與抑制流感病毒、免疫應(yīng)答及抗腫瘤相關(guān)［7-8］，而且該方法與傳統(tǒng)神經(jīng)氨酸酶抑制活性測(cè)定結(jié)果之間的相關(guān)性良好，方法簡(jiǎn)便、安全［9-12］。

前期實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根提取液中告依春和核苷類成分(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)存在熱不穩(wěn)定性，傳統(tǒng)熱回流提取時(shí)易降解損失，故前期采取減壓提取法，以最大限度保護(hù)熱敏性成分，避免熱分解。為保證后續(xù)制劑的穩(wěn)定有效，本實(shí)驗(yàn)一方面通過熱穩(wěn)定性測(cè)試，從動(dòng)力學(xué)角度測(cè)算中間體溶液的半衰期，而另一方面結(jié)合紅細(xì)胞凝集活性測(cè)試，為其工藝研究和質(zhì)量控制提供多維的評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)一步驗(yàn)證該提取工藝的合理性。

圖1 化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds

1 儀器與試劑

Agilent1200 系列HPLC 色譜儀(美國(guó)安捷倫公司);TG328A 電子天平(十萬分之一，德國(guó)Startorious 公司);UV2550 紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);V850 壓力控制器、Rotavapor R-200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(瑞士Buchi 公司);OLYMPUS U-TVIXC電子顯微鏡(廣州市明美科技有限公司);96 孔微量板(V 型、底角呈90°)、TDZ4A-WS 臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)。

板藍(lán)根藥材(批號(hào)1404004，江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司);尿苷對(duì)照品(批號(hào)NO. 8-130416，純度≥98%，50 mg)、鳥苷對(duì)照品(批號(hào)NO.7-110416，純度≥98%，50 mg)(中國(guó)固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心);腺苷對(duì)照品(批號(hào)X-022-121108，純度≥98%，50 mg，成都瑞芬思生物科技有限公司);PBS 緩沖液 (批號(hào)I110417，北京全式金生物技術(shù)有限公司)。水為雙蒸水(自制);乙腈、甲醇均為色譜純(美國(guó)Tedia 公司);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 常壓回流提取液的制備 參照《中國(guó)藥典》2010 版一部中板藍(lán)根顆粒的制備工藝，稱取板藍(lán)根藥材15 g，20 倍量水提取2 次，第1 次2 h，第2 次1 h，提取液過濾后合并，定容于1 000 mL量瓶中，即得。

2.1.2 減壓回流提取液的制備 參照前期優(yōu)選的減壓提取工藝條件，按“2.1.1”項(xiàng)下方法，將藥材置于減壓提取裝置中［13］，調(diào)節(jié)體系壓力為196 MPa，60 ℃下低溫沸騰提取2 次，第1 次2 h，第2 次1 h，提取液過濾后合并，定容于1 000 mL 量瓶中，即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取尿苷、鳥苷、腺苷、告伊春對(duì)照品適量，甲醇定容于10 mL量瓶中，搖勻，制成尿苷、鳥苷、腺苷、告伊春質(zhì)量濃度分別為10.5、10、10、20 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 色譜條件及方法學(xué)考察

2.3.1 色譜條件 Phenomenex Gemini C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0 ～10 min，2% A;10 ～20 min，2% ～15%A;20 ～25 min，15% ～100%A;25 ～35 min，100% A);檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量20 μL。

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對(duì)照品溶液1、3、5、8、10 mL，分別置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度線，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣20 μL，在245 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其峰面積。然后，以質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得到尿苷回歸方程Y =0.916 1X + 4.290 3 (r=0.999 1)、鳥苷回歸方程Y=1.393 7X + 3.769 8 (r =0.999 3)、腺苷回歸方程Y=1.656 4X + 10.032 (r =0.999 8)、告伊春回歸方程Y=3.514 4X-0.274 1 (r =0.999 6)。結(jié)果表明，尿苷在1.05 ～10.50 μg/mL、鳥苷和腺苷在1.00 ～10.00 μg/mL、告伊春在2.00 ～20.00 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液適量，注入HPLC 色譜儀，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)測(cè)定6 次，每次20 μL，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果，尿苷、鳥苷、腺苷、告伊春的峰面積RSD 值分別為0.67%、0.98%、1.03%、0.59%，說明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.1.2”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液6 份，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果，尿苷、鳥苷、腺苷、告伊春的峰面積RSD 值分別為1.32%、2.61%、0.74%、1.09%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果，尿苷、鳥苷、腺苷、告伊春的峰面積RSD 值分別為1.72%、1.31%、2.12%、0.79%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取尿苷、鳥苷、腺苷、告伊春對(duì)照品適量，加入含有量已知的供試品溶液中，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果，這4 種成分的平均回收率RSD 值均小于5.0%，說明該方法回收率良好。

2.4 不同提取工藝中有效成分的比較 分別精密吸取各供試品溶液20 μL，注入HPLC 色譜儀，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定尿苷、鳥苷、腺苷和告伊春的含有量。在常規(guī)提取法中，這4 種成分的含有量分別為0.7、0.77、0.57、0.84 mg/g;在減壓提取法中，這4 種成分的含有量分別為0.78、1.07、0.8、1.12 mg/g。

與常規(guī)提取法相比，減壓提取法中尿苷的提取率提高了11.4%，鳥苷的提取率提高了38.9%，腺苷的提取率提高了40.4%，告依春的提取率提高了33.3%，表明該方法的提取效率優(yōu)于常規(guī)提取法，推測(cè)可能在減壓狀態(tài)下，一方面，借助一定程度的真空度輔助，可促進(jìn)藥材內(nèi)部細(xì)胞間質(zhì)藥效成分得以快速溶出，加速提取傳質(zhì)過程的進(jìn)行，提高提取效率;另一方面，加熱時(shí)對(duì)系統(tǒng)抽真空，當(dāng)達(dá)到有效成分溶解最適宜溫度所對(duì)應(yīng)的真空度時(shí)，溶液即可沸騰，由于此溫度低于溶劑本身在常壓下的沸點(diǎn)，故可避免藥材有效成分受高溫破壞，而且，核苷類成分大多含酰胺基團(tuán)，在高溫和酸性條件下易分解。結(jié)果證實(shí)，減壓提取法能顯著提高板藍(lán)根中主要有效成分告依春及核苷類成分的提取率，最大限度地保護(hù)熱敏性有效成分，避免熱解。

2.5 熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別量取各供試品溶液100 mL，每組平行3 次，置于60 ℃水浴中，分別在第0、0.5、1、2、3、5、8、10 天取樣(取樣前用空白溶劑補(bǔ)足減失質(zhì)量)，離心處理后，0.22 μm 微孔濾膜過濾，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果見表1。由表可知，隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，不同方式板藍(lán)根提取液中告依春及核苷類藥效成分的含有量有明顯變化，呈下降趨勢(shì)。經(jīng)10 d高溫處理后，常規(guī)提取液中尿苷的含有量下降約30%，而減壓提取液中下降約32.1%;鳥苷的含有量下降約22.1%，而減壓提取液中下降約9.3%;腺苷的含有量下降約19.3%，而減壓提取液中下降約18.7%;告依春的含有量下降約36.9%，而減壓提取液中下降約27.7%。

表1 不同方式和時(shí)間處理后告依春及核苷類成分的保留率(±s，n=3)Tab.1 Retention rates of epigoitrin and nucleoside by different extraction techniques and heating time (±s，n=3)

表1 不同方式和時(shí)間處理后告依春及核苷類成分的保留率(±s，n=3)Tab.1 Retention rates of epigoitrin and nucleoside by different extraction techniques and heating time (±s，n=3)

時(shí)間/d 尿苷/(mg·g -1鳥苷/(mg·g -1))腺苷/(mg·g -1)告伊春/(mg·g -1)常規(guī)提取液 減壓提取液 常規(guī)提取液 減壓提取液 常規(guī)提取液 減壓提取液 常規(guī)提取液 減壓提取液57 ±0.01 0.80 ±0.01 0.84 ±0.01 1.12 ±0.02 0.5 0.64 ±0.02 0.73 ±0.02 0.76 ±0.01 1.06 ±0.04 0.55 ±0.01 0.72 ±0.02 0.82 ±0.01 1.07 ±0.02 1 0.59 ±0.01 0.70 ±0.03 0.75 ±0.01 1.04 ±0.02 0.53 ±0.02 0.71 ±0.01 0.77 ±0.01 1.06 ±0.01 2 0.57 ±0.03 0.69 ±0.01 0.73 ±0.02 1.03 ±0.03 0.51 ±0.02 0.69 ±0.02 0.70 ±0.01 1.05 ±0.04 3 0.56 ±0.02 0.64 ±0.01 0.72 ±0.02 1.02 ±0.02 0.50 ±0.01 0.69 ±0.02 0.67 ±0.01 1.04 ±0.01 5 0.53 ±0.02 0.62 ±0.02 0.67 ±0.00 0.99 ±0.02 0.49 ±0.02 0.67 ±0.02 0.64 ±0.01 1.03 ±0.01 8 0.50 ±0.02 0.55 ±0.02 0.66 ±0.01 0.98 ±0.03 0.47 ±0.01 0.66 ±0.02 0.62 ±0.01 0.89 ±0.03 10 0.49 ±0.01 0.53 ±0.01 0.60 ±0.01 0.97 ±0.03 0 0 0.70 ±0.03 0.78 ±0.01 0.77 ±0.01 1.07 ±0.03 0..46 ±0.01 0.65 ±0.01 0.53 ±0.02 0.81 ±0.02

2.6 熱降解動(dòng)力學(xué)分析 告依春及核苷類成分的保留率可看做其在溶液中的降解反應(yīng)，按照積分法來求熱解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程及反應(yīng)級(jí)數(shù)，而且文獻(xiàn)表明，在儲(chǔ)藏過程中，大多數(shù)與質(zhì)量有關(guān)的品質(zhì)變化都遵循零級(jí)或一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律［14］。根據(jù)化學(xué)動(dòng)力學(xué)中的Arrhenius 公式，繪制反應(yīng)動(dòng)力曲線，得到動(dòng)力學(xué)方程，推算其速率常數(shù)及半衰期，結(jié)果見表2。從表可知，不同溫度下熱處理方程的線性關(guān)系均良好(r ＞0.9)，表明回歸方程具有較高的擬合度，并表現(xiàn)出一級(jí)反應(yīng)特征。而且，常規(guī)提取液中反應(yīng)速率常數(shù)(K)普遍高于減壓提取液，說明這些成分在較高溫度下長(zhǎng)時(shí)間受熱時(shí)，易發(fā)生降解，同時(shí)前者中各指標(biāo)成分的熱降解速度明顯高于后者，而后者的熱穩(wěn)定性優(yōu)于前者，提示在生產(chǎn)過程中應(yīng)盡量避免高溫處理，低溫有利于保持其穩(wěn)定性。綜上所述，減壓(低溫沸騰)提取有助于延長(zhǎng)熱敏性有效成分的半衰期，增加藥液貯存期，保持藥物穩(wěn)定性。

表2 不同方式提取液中化學(xué)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.2 Kinetic parameters of epigoitrin and nucleoside by different extraction techniques

2.7 紅細(xì)胞凝集活性測(cè)試 研究表明，板藍(lán)根抑制流感病毒作用的強(qiáng)弱與其紅細(xì)胞凝集活性成正比，因此通過紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)，可表征板藍(lán)根抗病毒作用的效果，并應(yīng)用于其藥效評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)建立基于紅細(xì)胞凝集活性檢測(cè)的板藍(lán)根藥效考察方法。

2.7.1 紅細(xì)胞凝集樣品溶液的制備 分別取按“2.1”項(xiàng)下方法制成的不同方式供試品溶液100 mL，減壓濃縮至干，加PBS 緩沖液20 mL 溶解，無菌過濾，濾液置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，即得?/p>

2.7.2 紅細(xì)胞凝集活性檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［9］ 報(bào)道的方法，在V 型、底腳成90°的96 孔微量板上，PBS 緩沖液將供試品溶液稀釋2 倍，分別加入不同濃度的提取液50 μL，注入微量板中，平行2 束，在每排最后一孔中加入PBS 緩沖液50 μL，作為陰性對(duì)照，再向每孔中加入1%兔紅細(xì)胞混懸液50 μL，輕拍微量板，4 ℃下靜置2 h 后觀察結(jié)果。

2.7.3 紅細(xì)胞凝集活性判斷標(biāo)準(zhǔn)與效價(jià)計(jì)算 參照文獻(xiàn)［9］判定凝集結(jié)果，將微量板置于白色背景上，將供試品孔與陰性對(duì)照孔進(jìn)行比較，紅細(xì)胞沉于底部成一規(guī)則的圓點(diǎn)，而孔壁未粘有紅細(xì)胞者判為陰性(-);孔壁上均勻附著一層紅細(xì)胞，或紅細(xì)胞未全部沉于底部，部分附著于孔壁上者判為陽(yáng)性(+)，以供試品出現(xiàn)陽(yáng)性的最高稀釋倍數(shù)為判定終點(diǎn)，若同批供試品溶液前后排結(jié)果相差1 個(gè)以上稀釋度時(shí)應(yīng)重試，而相差1 個(gè)時(shí)，則以兩排結(jié)果中出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)較少的稀釋度為本品的判定終點(diǎn)。然后，計(jì)算各樣品的凝集效價(jià)，計(jì)算公式為U=n-Log2C，其中U 表示每1 g 供試品中含凝集活性單位的量;n 表示出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋倍數(shù);C 表示供試品溶液的初始質(zhì)量濃度(g/mL)，兩種不同方式提取液的紅細(xì)胞凝集效價(jià)結(jié)果見表3，顯微示意圖見圖2。結(jié)果，所測(cè)樣品均呈陽(yáng)性反應(yīng)，即不同方式的提取液均具有一定程度的抗病毒活性，而且減壓提取液的紅細(xì)胞凝集效價(jià)大于常規(guī)提取液，與效應(yīng)成分變化規(guī)律一致，進(jìn)一步證實(shí)由于長(zhǎng)時(shí)間熱處理可能加速效應(yīng)成分(告依春及核苷類)的降解損失過程，導(dǎo)致其含有量下降，藥效降低。

表3 不同方式提取液紅細(xì)胞凝集活性檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果Tab.3 Determination result of hemagglutination activity by different extraction techniques

圖2 不同方式提取液紅細(xì)胞凝集活性顯微示意圖(放大倍數(shù):40 ×10)Fig.2 Observation of hemagglutination activity by different extraction techniques (Image Magnification:40 ×10)

3 討論

文獻(xiàn)表明，告伊春及核苷類成分為板藍(lán)根制劑中主要的抗病毒有效成分［15-16］，而其大多含有酰胺基團(tuán)，在高溫和酸性條件下易分解，導(dǎo)致有效成分的保留率下降。傳統(tǒng)板藍(lán)根制劑往往要經(jīng)歷漫長(zhǎng)的熱處理過程，而指標(biāo)性成分的熱穩(wěn)定性將直接關(guān)系到中藥生產(chǎn)過程信息鏈的傳遞，故將嚴(yán)重影響后續(xù)制劑的質(zhì)量和臨床療效。本實(shí)驗(yàn)前期采用減壓提取法，在保證體系負(fù)壓的狀態(tài)下進(jìn)行回流提取，達(dá)到藥效成分溶解最適溫度所對(duì)應(yīng)的真空度時(shí)，溶液即可沸騰，一方面可避免藥效成分受熱降解，而另一方面可降低體系壓力。在氣壓和溫度的同時(shí)作用下，溶劑內(nèi)部分子不斷汽化，氣泡迅速升騰膨脹，不斷向四周稀溶液主體擴(kuò)散，加速傳質(zhì)擴(kuò)散過程，進(jìn)一步提高提取效率。通過比較不同方式提取液的熱穩(wěn)定性，結(jié)合藥效學(xué)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)板藍(lán)根藥材采用低溫沸騰減壓提取法時(shí)，與常規(guī)提取法相比，可增加效應(yīng)成分的提取率、減緩受熱降解的速度、延長(zhǎng)中間體藥液的儲(chǔ)存期和最終產(chǎn)品的有效期，以及提高藥效學(xué)活性等。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同方式提取液熱穩(wěn)定性的平行比較，結(jié)合藥效分析，考察了減壓提取技術(shù)應(yīng)用于板藍(lán)根制劑的合理性，可為其綜合開發(fā)利用提供參考。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，減壓提取法對(duì)含熱敏性成分藥材的提取具有廣泛的應(yīng)用前景。

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