羅燕玲 蔣龍?jiān)?符岳

心跳驟停是臨床常見的急危重癥，心跳驟停后心肺復(fù)蘇初期自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)成功的患者存活率低，只有1.4%～5%能相對正常生存出院[1]。在發(fā)生心跳驟停時(shí)，心臟血供完全中斷，予以高質(zhì)量的CPR后，也僅能提供正常心肌血流灌注水平的10%～20%[2-3]。本實(shí)驗(yàn)通過電刺激致顫法建立大鼠心肺復(fù)蘇模型，從線粒體水平研究全腦缺血后CPR對缺血缺氧后腦功能的保護(hù)作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號：scxk粵2004-0011)的SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重450～550 g。

二、方法

1.動物準(zhǔn)備與腦線粒體的分離： 應(yīng)用心搏驟停和心肺復(fù)蘇裝置[4-5]建立大鼠心跳驟停與心肺復(fù)蘇模型。 成年健康雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為3 組，每組8只大鼠。SD大鼠術(shù)前晚禁食，予戊巴比妥鈉濃度(45 mg/kg) 腹腔內(nèi)麻醉，備皮，仰臥位固定，經(jīng)口直視插入氣管鞘管。左股動脈置入23-0 PE-50 聚乙烯管監(jiān)測主動脈壓，右頸靜脈置3F 鞘管送入前端彎曲的指引鋼絲到達(dá)右心室內(nèi)膜，皮下插入針頭形成回路。對照組僅行麻醉，氣管插管，動靜脈置管，不誘導(dǎo)室顫。缺血組大鼠誘發(fā)室顫15 min，不行心肺復(fù)蘇(CPR)。CPR組：室顫誘發(fā)心臟驟停10 min，行5 min心肺復(fù)蘇。15 min后處死各組大鼠，斷頸取頭，分離出海馬組織。按1∶10 體積加入線粒體分離介質(zhì)，勻漿10 次至無腦組織塊。800 g 低溫離心4 min，取上清液；再以16 000 g 低溫離心15 min，棄上清，沉淀即為提取的線粒體。

2.檢測指標(biāo)： 采用Clark 氧電極法測定線粒體呼吸功能。反應(yīng)槽內(nèi)加入2．5 mL反應(yīng)介質(zhì)，充分?jǐn)嚢枋够A(chǔ)氧濃度達(dá)到240 nmol/mL 穩(wěn)定狀態(tài)，加入約2mg線粒體懸液孵育1 min，加入20 μL約4 mmol 琥珀酸二鈉，測得的氧消耗率為Ⅳ態(tài)呼吸(R4)。再加入20 μL 二磷酸腺苷， 測得氧消耗率為Ⅲ 態(tài)呼吸(R3)。線粒體呼吸控制率(RCR)=R3/R4。液氮凍存海馬神經(jīng)元線粒體通過效液相色譜檢測磷酸肌酸(PCr)、三磷酸腺苷(ATP)和乳酸(Lac)含量。經(jīng)固定，脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片后等處理后置于電鏡下觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)并記錄圖像。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、大鼠生理參數(shù)的比較

對照組、缺血組和CPR組的大鼠的基礎(chǔ)體質(zhì)量、復(fù)蘇前心率、平均動脈壓MAP比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 對照組、缺血組和CPR組大鼠生理參數(shù)比較

二、線粒體呼吸功能比較

Clark 氧電極測定呼吸功能結(jié)果顯示，缺血組和CPR 組大鼠腦組織線粒體呼吸功能均較對照組明顯下降，主要表現(xiàn)為R3 和RCR 值顯著降低(P<0.05)；但CPR組的R3 和RCR 高于缺血組(P<0.05)。見表2。

表2 對照組、缺血組和CPR組大鼠海馬組織線粒體呼吸功能比較

注:R3、R4單位：nmol/L·min-1·mg-1。與對照組比較：bP<0.05，aP<0.01；與缺血組比較:cP<0.05

三、能量代謝(PCr、ATP、乳酸含量)比較

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，缺血組和CPR組的海馬和皮層組織PCr和ATP含量均有不同程度下降(P<0.01)，其中缺血組PCr和 ATP含量的下降幅度更為明顯；缺血組和CPR組乳酸濃度與對照組相比有所升高(P<0.01)，其中缺血組升高幅度更為明顯(P<0.01)。見表3。

表3 對照組、缺血組和CPRZ組腦組織能量物質(zhì)(PCr、ATP)和乳酸(Lac)含量

注:與對照組比較:aP<0.01；與缺血組比較:bP<0.01

四、腦組織線粒體超微結(jié)構(gòu)

3組大鼠腦組織線粒體內(nèi)細(xì)胞胞體及細(xì)胞器無明顯腫脹，胞核圓形透明，核仁都比較明顯；線粒體結(jié)構(gòu)比較完整，排列整齊，嵴豐富；核糖體豐富，基質(zhì)密度均勻，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰明朗，形態(tài)學(xué)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

討 論

腦是人體各器官中對氧的需求最大的器官，腦的重量只占體重的2%，而耗氧量占人體總耗氧量的20%～30%，心臟輸出血量的15%都供給了腦。心跳驟停后CPR過程本質(zhì)上是全身缺血再灌注的過程，隨之引起廣泛的器官損傷，稱之為“心跳驟停后綜合征”，主要包括腦損傷，心肌功能障礙，全身性缺血再灌注反應(yīng)及持續(xù)誘因性病變[6]。在發(fā)生心跳驟停時(shí)，心臟血供完全中斷，此時(shí)“高質(zhì)量持續(xù)CPR”[7]在提高重要臟器再灌注血流水平就顯得非常重要。

圖1 大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu) 注：A.對照組;B.缺血組;C.CPR組

線粒體是糖類、脂肪和氨基酸等物質(zhì)最終氧化釋能的場所[8]，這些物質(zhì)進(jìn)入線粒體基質(zhì)中，參加三羧酸循環(huán)過程中釋放的能量，生成高能化合物ATP。線粒體中還存在著電子傳遞系統(tǒng)，調(diào)控著細(xì)胞各種能量物質(zhì)代謝過程。線粒體呼吸控制率(RCR)是指R3呼吸與R4呼吸之比，是評價(jià)線粒體結(jié)構(gòu)完整性及氧化磷酸化偶聯(lián)程度的敏感指標(biāo)，反映了線粒體氧化磷酸化效率[9]。

本研究的結(jié)果顯示,CPR組在室顫10 min后進(jìn)行5 min有效CPR，其腦組織線粒體態(tài)Ⅲ呼吸速率和呼吸控制率比單純15 min缺血組的損傷明顯較輕(P<0.05)。CPR組中PCr和ATP含量較對照組有所下降，與缺血組相比卻保持在較高水平，乳酸含量也比缺血組降低。通過電鏡分析，心跳驟停15 min后，腦神經(jīng)元細(xì)胞體及細(xì)胞器無明顯腫脹，胞核圓形透明，核仁明顯，線粒體結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，嵴豐富，基質(zhì)電子密度均勻，核糖體豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰。這結(jié)果提示我們，心跳驟停早期，線粒體損傷以功能性為主，線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)改變并不明顯；也提示我們，在心跳驟停后早期盡快實(shí)行高質(zhì)量的CPR，并早期開始高級生命支持，尤其是以腦功能恢復(fù)為目的的復(fù)蘇措施有重要意義。

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，心跳驟停5 min后腦損傷將是不可逆性的。而本實(shí)驗(yàn)觀察到心跳驟停后15 min腦線粒體超微結(jié)構(gòu)改變不明顯，只表現(xiàn)為能量代謝障礙，經(jīng)過有效的CPR可以改善線粒體的功能障礙，提示通過調(diào)節(jié)線粒體功能的措施應(yīng)該是潛在有希望的腦復(fù)蘇治療新靶點(diǎn)。目前，關(guān)于心跳驟停后全腦缺血損傷機(jī)制仍缺乏全面深入的了解，而目前證實(shí)有效的腦復(fù)蘇措施低溫治療在臨床中并沒有廣泛合理的推廣應(yīng)用，所以我們應(yīng)該規(guī)范治療流程同時(shí)進(jìn)一步尋求有效的腦復(fù)蘇措施。

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5 黃子通，方向韶． 心肺腦復(fù)蘇動物模型的標(biāo)準(zhǔn)化問題[J]．中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2009，18(1)：11．

6 Neumar RW，Nolan JP，Adrie C，et al.Post-cardiac arrest syndrome: epidemiology, pathophysiology, treatment, and prognostication. A consensus statement from the International Liaison Committee on Resuscitation (American Heart Association, Australian and New Zealand Council on Resuscitation, European Resuscitation Council, Heart and Stroke Foundation of Canada, InterAmerican Heart Foundation, Resuscitation Council of Asia, and the Resuscitation Council of Southern Africa); the American Heart Association Emergency Cardiovascular Care Committee; the Council on Cardiovascular Surgery and Anesthesia; the Council on Cardiopulmonary, Perioperative, and Critical Care; the Council on Clinical Cardiology; and the Stroke Council[J]. Circulation, 2008, 118(23): 2452-2483.

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8 周一凡,劉春曉.線粒體功能異常引起的疾病研究進(jìn)展[J].遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010，31(4):370-372.

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