刁雯靜，孫紅，郭奇桑，王麗，陶祥，隋龍

(復旦大學附屬婦產科醫(yī)院檢驗科，上海200011)

cornulin在宮頸病變中的表達及其差異

刁雯靜，孫紅，郭奇桑，王麗，陶祥，隋龍

(復旦大學附屬婦產科醫(yī)院檢驗科，上海200011)

目的了解宮頸炎、宮頸癌前病變及宮頸癌組織中cornulin的表達情況，初步評價cornulin與宮頸癌變的相關性。方法收集各個級別的宮頸癌前病變及可疑宮頸癌患者行診斷性或治療性經宮頸環(huán)形電切割術(LEEP)后的石蠟包埋組織標本131例，其中宮頸低級別鱗狀上皮內病變(LSIL)39例、宮頸高級別鱗狀上皮內病變(HSIL)49例、宮頸浸潤癌(ICC)43例，以38例宮頸炎患者作為對照組。所有標本經兔抗人cornulin多克隆抗體免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(SP)法顯示并評分。在行宮頸LEEP術之前取其宮頸脫落細胞，宮頸炎患者經陰道鏡下活檢病理診斷為慢性宮頸炎后取其宮頸脫落細胞，采用聚合酶鏈反應(PCR)測定cornulin基因的mRNA表達。結果免疫組化結果顯示，除宮頸炎組與宮頸LSIL組之間無差異(P=0.148)外，其余各組間cornulin蛋白表達差異均有統(tǒng)計學意義(P均=0.000);隨著宮頸病變級別的逐漸升高，cornulin蛋白表達逐漸下降，至ICC時表達明顯降低;cornulin mRNA的表達與其蛋白表達一致。以cornulin弱陽性(+)或陰性(-)作為篩查陽性指標，檢出宮頸HSIL以上病變的敏感性為70.7%，特異性為85.7%;檢出宮頸LSIL以上病變的敏感性為56.5%，特異性為94.7%。結論cornulin有望成為檢測宮頸病變程度的標記物之一。

cornulin;宮頸癌;免疫組化

宮頸癌的癌前病變亦稱為宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)，少部分宮頸低級別鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)可進一步發(fā)展為宮頸高級別鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)，只有0.1%～0.2%的患者在2年內進一步發(fā)展為宮頸浸潤癌(invasive cervical cancer，ICC)［1-2］。因此對于宮頸病變特別是宮頸LSIL的早期發(fā)現(xiàn)以及恰當?shù)闹委熅惋@得格外重要。目前，學者們更致力于研究宮頸癌前病變的組織學、分子生物學等方面的變化及其關系，尋找并發(fā)現(xiàn)相關的敏感指標，在幫助臨床早期更準確診斷CIN的級別，從而制訂個體化的治療和隨訪方案，在有效阻斷宮頸癌前病變進一步發(fā)展的前提下盡量減少不必要的過度治療。

ARNOUK等［3］應用蛋白質組學分析了正常宮頸上皮、HSIL以及宮頸癌組織的激光捕獲微切割(laser capture microdissection，LCM)樣本，發(fā)現(xiàn)在23個明確鑒定出的差異蛋白中，cornulin是唯一一個可以全部特異區(qū)分3種不同性質組織的分子標志物，在正常宮頸上皮、HSIL以及宮頸癌組織的表達水平呈逐級降低。cornulin又稱為CRNN、C1ORF10或SEP53，是融合基因家族中的一個新成員，融合基因家族即中間絲相關蛋白，該蛋白激酶家族定位于細胞漿內，多串聯(lián)重復，而且在氨基端有EF手結構域(即Ca2+結合區(qū)域)，其被認為與表皮的終末分化密切相關。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)此家族成員在人體內參與調節(jié)表皮細胞生長及分化，蛋白結構的穩(wěn)定性并與腫瘤的發(fā)展及預后密切相關。在表皮角化過程中與角質形成細胞的角蛋白絲相結合，被認為是角細胞分化的重要標志物［4-5］。大多數(shù)宮頸癌存在角細胞分化障礙，因此我們在ARNOUK等［3］研究的基礎上擴大了樣本量，并且設立了正常宮頸組織、宮頸LSIL、宮頸HSIL、ICC 4個組，欲了解cornulin在宮頸病變的不同階段的表達差異情況，初步探討cornulin表達與宮頸癌前病變以及宮頸癌發(fā)生的相互關系。

材料和方法

一、病例來源及取材

收集復旦大學附屬婦產科醫(yī)院宮頸科2009年10月份至2011年12月份收治的各個級別的宮頸癌前病變行經宮頸環(huán)形電切割術(loop electrosurgical excision procedure，LEEP)后的標本131例，患者術前均經陰道鏡下活檢病理明確診斷，且131例患者陰道鏡下活檢病理與其LEEP術后病理級別均一致。將患者按病理結果分為宮頸LSIL組39例(包括宮頸扁平濕疣13例、CIN I 26例)，宮頸HSIL組49例(包括CINⅡ4例、CINⅡ～Ⅲ14例、CINⅢ31例)，ICC組43例。并收集38例宮頸炎組織(陰道鏡病理診斷為慢性宮頸炎)標本作為對照。所有患者取材前未行婦科檢查，24 h內無性生活，并排除陰道炎癥。所有切片均經過兩位病理科醫(yī)生診斷復核。

二、主要試劑

一抗兔抗人cornulin多克隆抗體(英國Abcam公司)、EnVision試劑盒(丹麥DAKO公司)、TRIZOL合成試劑盒(美國Invitrogen公司)、cDNA合成試劑盒(美國Fermentas公司)。Taq聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR) MasterMix試劑盒［天根生化科技(北京)有限公司］。

三、免疫組織化學法［免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(streptavidinperoxidase，SP)法］

將組織標本進行脫蠟、水化，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗2～3次，每次5 min。將3%H2O2(80%甲醇)滴加在玻璃片上，室溫靜置10 min，PBS洗2～3次，每次5 min。抗原修復:置0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH值6.0)中用煮沸(微波爐可高火4次，每次6 min)，自然冷卻30 min以上至室溫，PBS洗2～3次，每次5 min。滴加正常山羊血清封閉液，室溫靜置20 min，甩去多余液體。滴加一抗(兔抗人cornulin多克隆抗體)50 μL，室溫靜置1 h或4℃過夜或37℃1 h，如為4℃過夜后需在37℃復溫45 min。PBS洗3次，每次5 min。滴加二抗(羊抗兔IgG)40～50 μL，室溫或37℃靜置1 h，二抗中可加入0.05%Tween-20。PBS洗3次，每次5 min。DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度。PBS或自來水沖洗10 min。蘇木精復染2 min，鹽酸酒精分化，自來水沖洗10～15 min。最后脫水、透明、封片、鏡檢。

cornulin染色陽性以胞核和胞漿內出現(xiàn)棕黃色顆粒為主。染色判讀標準:基本不著色為0分、著淡黃色為1分、著色適中為2分、著色深黃為3分;著色細胞占總細胞數(shù)＜5%為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、＞50%為3分。將每張切片的著色程度得分和著色細胞數(shù)得分相乘為最后得分:0～1分為陰性(-)、2～3分為弱陽性(+)、4～5分為陽性(++)、6～9分為強陽性(+++)。

四、宮頸脫落細胞cornulin基因逆轉錄PCR (reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測

cornulin引物序列合成引物見表1，以β-actin為內參照?？偡磻w系為20 μL，含有cDNA 2 μL，2×PCR Master Mix 10 μL，每個引物(濃度為10 mmol/L)各1 μL。擴增條件:95℃預變性5 min;95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s;各待檢基因循環(huán)數(shù)經過優(yōu)化以確保各自反應處于指數(shù)增長期，其中cornulin為32個循環(huán)，β-actin為30個循環(huán);最后72℃延伸5 min。

表1 引物序列

五、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計分析。各組間樣本率比較用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、cornulin蛋白的免疫組化結果

隨著宮頸癌前病變級別的逐漸升高，cornulin蛋白的表達強度逐漸下降，至ICC時表達明顯降低。見圖1和表2。宮頸炎組cornulin蛋白表達與宮頸HSIL組、ICC組比較差異均有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為41.597、60.850，P=0.000);宮頸LSIL組cornulin蛋白表達與宮頸HSIL組、ICC組比較差異均有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為27.272、41.480，P=0.000);宮頸HSIL組cornulin蛋白表達與ICC組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.656，P=0.000);宮頸炎組與宮頸LSIL組之間cornulin蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(χ2=5.343，P= 0.148)。

圖1 不同病理級別宮頸病變cornulin蛋白的表達情況

二、cornulin作為ICC及其癌前病變篩查指標的敏感性以及特異性

以cormulin免疫組化(+)或(-)作為篩查陽性指標，對檢出不同病理級別宮頸病變的“敏感性+特異性”達到最高，因此采用cornulin (+)/(-)作為ICC及其癌前病變的篩查陽性指標，以cornulin(++)/(+++)作為ICC及其癌前病變的篩查陰性指標。結果顯示檢出宮頸HSIL以上病變(即宮頸HSIL/ICC)的敏感性為70.7%、特異性為85.7%。檢出宮頸LSIL以上病變(即宮頸LSIL/宮頸HSIL/ICC)的敏感性為56.5%、特異性為94.7%。見表3。

表2 各組cornulin免疫組化染色結果(例)

表3 cornulin作為ICC及其癌前病變篩查指標的敏感性以及特異性(%)

三、cornulin mRNA的RT-PCR結果

除宮頸炎組與宮頸LSIL組外，其余各組間cornulin mRNA表達差異均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)，與cornulin蛋白的表達同步。見圖2和表4。

圖2 各組cornulin mRNA的RT-PCR結果

表4 cornulinmRNA的RT-PCR結果

討論

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)ICC的發(fā)生、發(fā)展是多基因共同作用的結果。盡早發(fā)現(xiàn)并且治療宮頸癌前病變可有效降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率。對于宮頸癌前病變準確的診斷和恰當?shù)闹委煵粌H可有效阻斷其向宮頸癌進一步發(fā)展，同時也避免不必要的過度治療，提高患者的生活質量。

陰道鏡下活檢的準確性主要決定于陰道鏡醫(yī)生的經驗和判斷，根據(jù)美國陰道鏡檢查與宮頸病理學會(American Society for Colposcopy and Cervical Pathology，ASCCP)的診療指南，經陰道鏡下活檢為宮頸LSIL患者后續(xù)治療主要是根據(jù)其新柏氏液基細胞學(thinprep cytologic test，TCT)檢測結果［6］，但前提是陰道鏡下活檢準確率在一定的質控范圍內。由于我國醫(yī)療資源的缺乏，特別是偏遠地區(qū)有資質的陰道鏡醫(yī)生有限，有些醫(yī)生甚至在肉眼下進行宮頸活檢，往往得出的結果是片面的，宮頸病變漏診率非常高。后續(xù)的LEEP術在彌補了許多病例可能漏診的同時，也提高了過度治療的概率。然而，宮頸LSIL的過度治療亦存在很大弊端。LEEP也有高達13.2%的圍術期并發(fā)癥，常見的有術中或術后出血、感染等，且發(fā)生率隨切除組織量和深度的增加而升高［7］，部分病例LEEP術后發(fā)生宮頸或頸管部位的子宮內膜異位［8］，LEEP還與術后妊娠合并足月前胎膜早破、早產及低出生體重兒風險增高有關［9］。

那么在缺乏醫(yī)療資源的地區(qū)怎樣判斷陰道鏡下活檢提示陽性者，特別是宮頸LSIL患者是否需要進一步行LEEP術呢?除了參考其TCT結果外，還需要尋求更多準確、客觀地指標來進一步確診其病理級別，在不漏診的前提下盡量避免不必要的治療帶來的身心損傷。

ARNOUK等［3］發(fā)現(xiàn)了cornulin是一個可以全部特異區(qū)分3種不同性質宮頸組織的分子標志物。鑒于宮頸LSIL治療的多樣性和可選擇性，本研究在ARNOUK等［3］的實驗基礎上加入了宮頸LSIL組，并且除了觀察cornulin蛋白的差異情況，還增加了對cornulin mRNA的RT-PCR的研究。結果顯示除了宮頸炎(即正常宮頸上皮)組和宮頸LSIL組之間cornulin蛋白和cornulin mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)外，其余各組之間無論cornulin蛋白還是cornulin mRNA的表達差異均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。

關于cornulin的生物學功能目前仍少有研究。有研究發(fā)現(xiàn)cornulin在鱗狀上皮應激反應過程中表達增加，提示其可能是一種熱休克蛋白［10］。cornulin基因在舌鱗癌、食管鱗癌［11］、宮頸癌組織中的表達均降低，其可能在部分鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中通過細胞周期阻滯作用反向調節(jié)癌細胞的增殖。

由于80%以上的宮頸癌存在角細胞分化障礙，cornulin在宮頸癌組織中往往呈低表達。本研究結果進一步證實了隨著宮頸病變病理級別的逐漸升高，cornulin蛋白的表達強度逐漸下降，至ICC時cornulin蛋白表達明顯減低，并且cornulin mRNA的表達與其蛋白同步。另外本研究以cornulin(+)/(-)作為陽性篩查指標，檢出宮頸HSIL以上病變的敏感性為70.7%、特異性為85.7%，檢出宮頸LSIL以上病變的敏感性為56.5%，特異性為94.7%。因此將cornulin作為篩查指標對于檢出宮頸不同級別病變均有較高的特異性。cornulin可能有望成為輔助診斷宮頸LSIL和宮頸HSIL以上病變的特異性篩查指標。臨床上結合患者TCT病理診斷結果使有宮頸病變的患者可以得到一個更全面的評估，可以給患者特別是宮頸LSIL的患者提供更多元化的治療方案。然而，cornulin將來是否可以實際應用于臨床仍需更大樣本量、更深層次的相關研究。

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The exp ression and its difference of cornulin in cervical lesions

DIAO Wenjing，SUN Hong，GUO Qisang，WANG Li，TAO Xiang，SUI Long.(Department of Clinical Laboratory，Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University，Shanghai 200011，China)

ObjectiveTo study the cornulin expressions in cervicitis tissue，cervical intraepithelial neoplasia tissue and cervical cancer tissue，and to evaluate preliminarily the correlation of cornulin with cervical intraepithelial neoplasia tissue.MethodsA total of 131 paraffin-embedded tissue samples were collected from cervical intraepithelial neoplasia and suspicious cervical cancer patients undergoing loop electrosurgical excision procedure(LEEP)for diagnostics or treatment.They included 39 patients with low-grade squamous intraepithelial lesion(LSIL)，49 patients with high-grade squamous intraepithelial lesion(HSIL)，43 patients with invasive cervical cancer(ICC)，and 38 patients with cervicitis were enrolled as control group.Immunohistochemistry［streptavidin-peroxidase(SP)］using a rabbit polyclonal antibody against human cornulin was applied in all samples.Polymerase chain reaction(PCR)was used for the determination ofcornulinmRNA expression in all 131 patients＇cervical thinprep cytologic test samples prior to cervical LEEP procedure and control group＇s cervical thinprep cytologic test samp les after histopathology diagnosis by colposcopy.ResultsImmunohistochemistry showed that the expression levels of cornulin were significantly different with the other groups(P=0.000)except that between LSIL and control group(P=0.148).With the severity degree of cervical disease increasing，the expression of cornulin decreased，and it decreased significantly in ICC.The expression of cornulin mRNA was consistent with the results of cornulin expression level.If taking cornulin weakly positive(+)or negative(-)as the cut-off for screening cervical HSIL or higher，the sensitivity was 70.7%，and the specificity was 85.7%.And for screening cervial LSIL or higher，the sensitivity was 56.5%，and the specificity was 94.7%.ConclusionsCornulin might be one of the useful markers for cervical carcinogenesis.

Cornulin;Cervical cancer;Immunohistochemistry

1673-8640(2015)09-0898-05

R446.1

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.008

2014-11-30)

(本文編輯:龔曉霖)

中國癌癥基金會資助項目(E12012001)

刁雯靜，女，1979年生，碩士，主治醫(yī)師，主要從事婦產科相關疾病的檢驗工作。

孫紅，聯(lián)系電話:021-63455050。