崔明華，李龍珠，劉家軍，張 梅，郭俐宏，彭吉霞*

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桂枝茯苓丸對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

崔明華1，李龍珠2a，劉家軍2b，張 梅2a，郭俐宏3，彭吉霞3*

目的 采用皮下移植自體子宮內(nèi)膜組織的方法建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，觀察桂枝茯苓丸對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響。方法 50只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照、模型組、米非司酮組、桂枝茯苓丸A、B組，其中模型組、米非司酮組及桂枝茯苓丸A、B組均制作大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型。術(shù)后桂枝茯苓丸A、B組用桂枝茯苓丸灌胃治療21 d，米非司酮組灌陽性藥米非司酮，空白對(duì)照組及模型組灌等體積生理鹽水。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法測(cè)定大鼠子宮內(nèi)膜組織VEGF及mRNA、低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)及HIF-1 mRNA表達(dá)，測(cè)定血清雌二醇(E2)及白介素-8(IL-8)水平，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)、雌激素受體(ERα)。結(jié)果 桂枝茯苓丸A、B組VEGF及mRNA、HIF-1α及HIF-1 mRNA在子宮內(nèi)膜組織上表達(dá)下調(diào)，E2、IL-8水平及PCNA、ERα表達(dá)量均明顯降低，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 桂枝茯苓丸可抑制模型大鼠異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)與血管生成，減輕子宮內(nèi)膜異位癥血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠子宮內(nèi)膜異位癥有治療作用。

桂枝茯苓丸；子宮內(nèi)膜異位癥模型；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

0 引言

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EM)是一類具有侵襲性的良性腫瘤，具有生長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜細(xì)胞經(jīng)輸卵管進(jìn)入盆腔異位生長(zhǎng)而形成的一種女性常見婦科疾病，孕齡階段婦女好發(fā)［1］。出現(xiàn)月經(jīng)失調(diào)、盆腔痛、不孕、盆腔炎性包塊等臨床癥狀，孕齡階段婦女發(fā)病率10%～15%，嚴(yán)重影響女性的生育及心理健康［2］。發(fā)病誘因多認(rèn)為在機(jī)體免疫力降低時(shí)缺乏對(duì)異位子宮內(nèi)膜免疫監(jiān)視和識(shí)別，內(nèi)膜組織細(xì)胞種植在非子宮腔被覆黏膜部位并異位生長(zhǎng)［3］?！督饏T要略·婦人妊娠病脈癥并治篇》謂桂枝茯苓丸具有活血消癥化瘀之功效，用于婦女血瘀經(jīng)閉、癥塊、惡露等頑疾。本實(shí)驗(yàn)用桂枝茯苓丸灌胃治療大鼠子宮內(nèi)膜異位癥，觀察其對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥VEGF等表達(dá)的影響，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠40只，鼠齡50～60 d，體重(200±20)g，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、達(dá)那唑組(陽性藥物對(duì)照)、桂枝茯苓丸A、B組，每組10只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證：SYXK(鄂)2011-0031，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(鄂)2011-0008。動(dòng)物房溫度18～25 ℃，濕度50%～75%，12 h交替光照，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，每日觀察動(dòng)物進(jìn)食情況，稱體重，及時(shí)清理糞便。

1.2 儀器及藥品 桂枝茯苓丸注射液(成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字Z20027562)；VEGF、HIF-1α、ERα、PCNA試劑盒(北京博凌科為生物科技有限公司)，提取mRNA試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑(美國Invitrogen公司)；IL-8試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20130507)。米非司酮(上海新華聯(lián)制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20000628，10 mg/支)。ERα、PCNA顯色劑(北京中杉金橋公司，產(chǎn)品編號(hào)：SC-542、ZM-0123)。

1.3 子宮內(nèi)膜異位癥模型制備 參照彭艷等［4］改良子宮內(nèi)膜皮下移植法，術(shù)前經(jīng)陰道涂片檢查篩選處于動(dòng)情期大鼠造模，所有動(dòng)物在造模前夜停止喂食，不禁水，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(120 mg/kg)麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)。于腹正中、恥骨聯(lián)合上2 cm打開腹腔(長(zhǎng)2～3 cm)，子宮位于膀胱后側(cè)并向腹腔上兩端延伸。術(shù)中近端離右側(cè)子宮角1 cm處結(jié)扎，遠(yuǎn)端離卵巢1 cm處結(jié)扎后切下子宮，放入無菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中縱向剖開。分離子宮內(nèi)膜與肌層，剪3塊3 mm×5 mm的子宮內(nèi)膜組織備用。子宮內(nèi)膜皮下移植法：在腹壁切口右側(cè)從腹肌與皮下筋膜層之間打隧道，以正好能置入子宮內(nèi)膜片為宜，取1塊子宮內(nèi)膜組織平整的置入右側(cè)隧道底部，4周后模型復(fù)制成功。

1.4 治療方法 于造模4周后，根據(jù)米非司酮臨床治療子宮內(nèi)膜異位癥劑量(25 mg/d)，按大鼠體表面積換算米非司酮用量(換算后大鼠用量為2.5 mg/d)，桂枝茯苓丸A、B組用量分別為10、20 mg/d。A、B組分別用不同劑量桂枝茯苓丸灌胃治療；米非司酮組用陽性藥米非司酮2.5 mg/d灌胃治療；空白對(duì)照組及模型組灌等體積生理鹽水。5組均連續(xù)治療21 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo) 參照文獻(xiàn)［2］，治療21 d后分別取5組大鼠子宮內(nèi)膜組織暫存在-30 ℃低溫冰箱保存待測(cè)。檢測(cè)時(shí)以3 000 r/min 離心(離心半徑70 mm)取上清液，嚴(yán)格按SP試劑盒說明操作，采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定子宮內(nèi)膜組織VEGF蛋白質(zhì)及mRNA、FLH-1α及FLH-1α mRNA，ERα、PCNA及IL-8。

2 結(jié)果

2.1 桂枝茯苓丸對(duì)大鼠心肌VEGF、VEGF mRNA表達(dá)的影響 空白對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF、VEGF mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組在子宮內(nèi)膜異位癥模型制備成功后VEGF、VEGF mRNA在子宮內(nèi)膜組織表達(dá)明顯增強(qiáng)，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。桂枝茯苓丸A、B組在治療21 d后VEGF、VEGF mRNA子宮內(nèi)膜組織表達(dá)明顯下調(diào)，與空白對(duì)照組、模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但桂枝茯苓丸A、B組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 桂枝茯苓丸對(duì)大鼠HIF-1α、HIF-1α mRNA表達(dá)的影響 治療21 d后，HIF-1α、HIF-1α mRNA在子宮內(nèi)膜組織上均有表達(dá)，桂枝茯苓丸組A、B子宮內(nèi)膜HIF-1α、HIF-1α mRNA子宮內(nèi)膜組織上的陽性表達(dá)均明顯下調(diào)，與空白對(duì)照組、模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。桂枝茯苓丸A、B組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2.3 桂枝茯苓丸對(duì)大鼠E2、ERα的影響 ERα在空白對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞胞核及細(xì)胞間質(zhì)有少量表達(dá)，模型組則表達(dá)上調(diào)，血清E2含量明顯升高，桂枝茯苓丸A、B組ERa表達(dá)量及血清E2含量明顯降低，與空白對(duì)照組、模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，桂枝茯苓丸A、B組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

2.4 桂枝茯苓丸對(duì)大鼠PCNA表達(dá)量及IL-8水平的影響 桂枝茯苓丸A、B組PCNA表達(dá)量及IL-8水平明顯降低，與空白對(duì)照組、模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，桂枝茯苓丸A、B組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 桂枝茯苓丸對(duì)大鼠VEGF、VEGF mRNA表達(dá)的影響(n=10)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表2 桂枝茯苓丸對(duì)大鼠HIF-1α、HIF-1α mRNA陽性表達(dá)的影響(n=10)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表3 桂枝茯苓丸對(duì)大鼠E2、ERα表達(dá)量影響(n=10)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表4 桂枝茯苓丸對(duì)大鼠PCNA表達(dá)量及IL-8的影響(n=10)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，子宮內(nèi)膜異位癥屬于“不孕”、“癮瘕”、“痛經(jīng)”范疇，其病理機(jī)制為子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、黏附異常造成［5］，氣滯血瘀、七情內(nèi)傷、肝腎功能失調(diào)等導(dǎo)致陰血虧虛、陰陽失調(diào)，因此，中醫(yī)以軟堅(jiān)散結(jié)、活血化瘀、滋陰補(bǔ)腎等為治療原則［6］。桂枝茯苓丸出自于《金匱要略》，方中桃仁味苦甘平，桂枝辛甘而溫，丹皮味苦而微寒，可涼血散瘀，芍藥止痛；茯苓性甘平，滲濕祛痰，可益胃健脾、消癮而扶正氣，五藥合用，共奏活血化瘀、緩消癮塊，專治“婦人宿有癩病”［7］。 子宮內(nèi)膜異位癥為雌激素依賴性疾病，子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)時(shí)，雌激素與ERα特異性結(jié)合，激活子宮內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)E2大量分泌，雌激素在靶組織中產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的強(qiáng)弱取決于靶細(xì)胞中雌激素受體ERα的水平［8］。而PCNA是一種核內(nèi)合成DNA所必須的酸性核蛋白，其合成、表達(dá)與細(xì)胞的增殖密切相關(guān),常作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖，反映細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)的指標(biāo)［9］。VEGF是一種高度特異性的促血管生長(zhǎng)因子，可以促進(jìn)多種血管活性物質(zhì)合成、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移再生，故VEGF在臨床上常作為評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮功能的重要指標(biāo)之一［10］。故本研究通過VEGF、E2、ERα、PCNA等指標(biāo)來觀察分析桂枝茯苓丸對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的治療作用。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過桂枝茯苓丸治療21 d后，A、B組VEGF及mRNA、HIF-1α、HIF-1α mRNA在子宮內(nèi)膜組織上表達(dá)均下調(diào)，血清E2、IL-8水平明顯降低，PCNA及ERα在子宮內(nèi)膜表達(dá)明顯減少。分析認(rèn)為，正常子宮內(nèi)膜存在少量的VEGF，子宮內(nèi)膜在異位種植的過程中由于缺氧，在HIF-1α、VEGF通路的調(diào)節(jié)下，上調(diào)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜血管新生。在經(jīng)桂枝茯苓丸治療21 d后，大鼠VEGF、VEGF mRNA、HIF-1α、HIF-1α mRNA在子宮內(nèi)膜組織上表達(dá)均下調(diào)，說明桂枝茯苓丸可以明顯抑制HIF-1α、HIF-1 mRNA進(jìn)而減少異位內(nèi)膜組織VEGF及VEGF mRNA表達(dá)水平，抑制異位內(nèi)膜血管內(nèi)皮的分化及新生，由此改善內(nèi)異癥患者盆腔內(nèi)環(huán)境，從而抑制異位內(nèi)膜組織的生長(zhǎng)。這與萬貴平等［11］研究桂枝茯苓丸下調(diào)HIF-1α的水平，進(jìn)而降低HIF-1α啟動(dòng)的VEGF基因的表達(dá)一致。PCNA及ERα在子宮內(nèi)膜表達(dá)減少的同時(shí)血清E2下降，這可能是桂枝茯苓丸通過下調(diào)HIF-1α的表達(dá)而顯著抑制異位內(nèi)膜中的PCNA。其顯著抑制ERα受體，減少了雌激素與之特異性結(jié)合，使血清E2合成明顯減少，進(jìn)而改善血液卵泡刺激素與血液黃體生成素水平，增強(qiáng)免疫力而達(dá)到緩解子宮疼痛與痙攣的目的［12］。機(jī)體重要炎癥介質(zhì)IL-8、IL-6等可在機(jī)體感染及其他無菌性炎癥反應(yīng)時(shí)，誘導(dǎo)激活T、B淋巴細(xì)胞分化，增加中性粒細(xì)胞溶酶體酶的活性及T、B淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能。本實(shí)驗(yàn)在治療后IL-8降低，提示桂枝茯苓丸通過下調(diào)IL-8，降低T、B淋巴細(xì)胞分化，干預(yù)炎癥細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞過多進(jìn)入異位子宮內(nèi)膜組織，阻斷IL-8介導(dǎo)激活單核巨噬細(xì)胞活化及炎性浸潤，避免盆腔由于炎癥反應(yīng)出現(xiàn)局部組織粘連、纖維化造成子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，桂枝茯苓丸具有活血化瘀、調(diào)理經(jīng)絡(luò)的治療效果［13］，其藥理作用與米非司酮(陽性對(duì)照藥物)相似，可抑制模型大鼠子宮異位內(nèi)膜組織VEGF、HIF-1α表達(dá)，抑制異位子宮內(nèi)膜組織生長(zhǎng)與血管生成，阻止雌激素與ERα結(jié)合，降低E2分泌，阻斷IL-8介導(dǎo)炎性浸潤，減輕子宮內(nèi)膜異位癥血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)性子宮內(nèi)膜異位癥有治療作用。

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Effect of guizhi fuling pill on the expression of vascular endothelial growth factors in endometriosis rats

CUI Ming-hua1,LI Long-zhu2a,LIU Jia-jun2b,ZHANG Mei2a,GUO Li-hong3,PENG Ji-xia3*

(1.Deprtment of Obstetrics and Gynecology,Taihe Hospital in Shiyan City,Shiyan 442000，China；2.a.Department of Obstetrics and Gynecology,b.Department of Gastroenterology,Hospital of Traditional Chinese Medicine of Shiyan City,Shiyan 442000,China;3.Functional Laboratory of Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China)

Objective To establish the rat endometriosis model by using the method of subcutaneous transplantation of autologous endometrial tissue,to observe the effect of guizhi fuling pill on the expression of vascular endothelial growth factors in model endometriosis rats.Methods 50 rats were randomly divided into control group,model group,mifepristone group,guizhi fuling pill A,B group.Model group,mifepristone group and guizhi fuling A,B group were made as rat endometriosis model.Guizhi fuling pill A,B group were given guizhi fuling bolus gavage for 21 d,mifepristone group was given positive medicine danazol,control group and model group were administrated with normal saline.The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method was used for the determination of rat uterine endometrial tissue VEGF and mRNA,hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) and the expression of HIF-1 mRNA,the determination of serum estradiol (E2) and interleukin-8 (IL-8) level,the proliferating cell nuclear antigen (PCNA),estrogen receptor (ERα) were detected by immunohistochemistry.Results The expression of VEGF and mRNA,HIF-1α and HIF-1 mRNA in endometrial tissue in guizhi fuling pill A,B group were down regulated,and the expression of E2,IL-8 level and PCNA,ERα volume significant reduced compared with those of model group (P<0.05).Conclusion The growth and angiogenesis of ectopic endometrium guizhi fuling pill can inhibit the growth of rat endometriosis,reduce vascular endothelial inflammation and has therapeutic effects on experimental rats with endometriosis.

Guizhi fuling pills;Endometriosis model;Vascular endothelial growth factor

2015-03-13

1.湖北省十堰市太和醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 十堰 442000；2.湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院a.婦產(chǎn)科，b.消化科，湖北 十堰 442000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰 442000

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201509004