李會端，崔 旭，耿仕香

(楚雄師范學院化學與生命科學學院，云南 楚雄 675000)

前言

黃酮類化合物是植物次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于天然植物中，因其具有消炎殺菌、抗氧化、抗病毒、提高人體免疫力等藥效，在醫(yī)藥和臨床應(yīng)用領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用前景［1－5］。蘋果中富含類黃酮化合物，Tsao等采用液相色譜法測定了八個蘋果品種中的類黃酮含量，測定結(jié)果顯示蘋果皮中的類黃酮含量在834.2－2300.3mg·kg－1，而果肉中的類黃酮含量在15－605.6 mg·kg－1，不難分析得出蘋果中的總黃酮化合物主要集中在果皮部分，果肉和果心中的含量遠低于果皮［6］。由于多數(shù)類黃酮沒有標準品，文獻中報道的蘋果中總黃酮的含量測定多采用分光光度法［7－8］。聶繼云等對蘋果中總黃酮提取實驗條件進行了優(yōu)化，用分光光度法測定了蘋果果實中總黃酮含量［9］。文獻中還報道了超聲波輔助法提取蘋果中總黃酮的相關(guān)研究工作［10］。

雖然文獻報道的研究數(shù)據(jù)表明蘋果中總黃酮類化合物集中分布在果皮，然而蘋果果皮中總黃酮的提取和含量測定的研究卻鮮有報道［10－12］，本文初次嘗試選用云南昭通金帥蘋果為原料，采用乙醇浸提蘋果皮中總黃酮，設(shè)計單因素和正交實驗優(yōu)化浸提工藝條件，以蘆丁為對照，采用紫外－分光光度法測定提取液中總黃酮含量，初步探究蘋果皮黃酮提取液對羥自由基的抑制活性，為蘋果營養(yǎng)成分的鑒定和開發(fā)利用提供黃酮分布和含量的基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)參考。

1.材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

昭通金帥蘋果(采自昭通云南)，采摘蘋果→洗凈蘋果果皮→自然陰干→粉碎→備用。

蘆丁、鹽酸、鋅粉、亞硝酸鈉、三氯化鋁、硼酸、硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉、BHT等均為分析純。CP214c電子天平 (奧豪斯儀器上海有限公司)、DFY－500搖擺式高速中藥粉碎機、HH－S2S 水浴恒溫鍋、容量瓶、吸量管、SHZ－IIIA真空泵、分光光度計、恒溫干燥箱等。

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮提取率的計算方法

以蘆丁為對照，紫外分光光度法測定昭通金帥蘋果皮浸提液中總黃酮的含量。測試原理及過程如下:移取一定體積的蘋果皮浸提液配置待測液，先后加入5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液和4%氫氧化鈉溶液，浸提液中總黃酮堿性條件與鋁鹽形成穩(wěn)定絡(luò)合物，此絡(luò)合物在510nm處有穩(wěn)定的特征吸收峰，且吸光度值與測試液中總黃酮濃度服從朗伯－比爾定律。根據(jù)蘆丁標準曲線，將所測樣品吸光度值代入線性回歸方程求出測試樣品液中總黃酮濃度，計算提取物中總黃酮的含量。

設(shè)原料中黃酮類化合物的含量為x，稀釋后測試液總黃酮濃度為C;原浸提液總黃酮濃度為C0。

1.2.2 總黃酮對羥基自由基的抑制活性

參照Fenton體系，H2O2與Fe2+混合可活化氧自由基·OH，若向Fenton體系中加入水楊酸，水楊酸與·OH反應(yīng)產(chǎn)生510nm處有特征強吸收峰的有色絡(luò)合物。若向Fenton體系中加入具有·OH抑制活性的總黃酮，競爭效應(yīng)使得有色絡(luò)合物生成量減少。固定反應(yīng)時間，在510nm處測含有總黃酮浸提液的吸光度值，與空白液對照，進而間接測定總黃酮浸提液對·OH的抑制活性。

·OH抑制活性計算公式:清除率 (%)=［A0－ (Ax－Ax0)］/A0×100%

其中:A0為空白液吸光度;Ax為含有總黃酮浸提液的體系吸光度;Ax0為不加H2O2含有總黃酮浸提液的本底吸光度。

2.實驗與結(jié)果分析

2.1 蘆丁標準溶液的制備，標準曲線的繪制和最大吸收波長的選擇

2.1.1 制備蘆丁標準溶液

準確稱取0.0100 g蘆丁，在105℃干燥箱中恒重半小時，取出加濃度為75%乙醇置于小燒杯中溶解，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用相同濃度的乙醇溶液洗滌燒杯，將洗滌液合并轉(zhuǎn)移定容至標定刻度，制得0.20 mg·mL－1蘆丁標準溶液，備用。

2.1.2 選擇最大吸收波長

用吸量管分別準確吸取1.00 mL蘆丁溶液和蘋果皮總黃酮浸提液于50mL容量瓶中，先后加入5%的NaNO21.00mL，10%的Al(NO3)34.00mL，4%的NaOH 4.00mL，最后用75%乙醇定容至50mL，振蕩混勻，靜置。試劑空白作參比，在375～620nm波段范圍掃描測定吸光度，確定測定最大吸收峰波長。蘆丁溶液和蘋果皮總黃酮浸提液的吸收光譜如圖1所示，開始階段隨著掃描波長增加，吸光度值單調(diào)遞增，510nm波長處測得最大吸收峰;再增加掃描波長，吸光度開始降低。故確定510nm為蘋果皮總黃酮的最大吸收波長。

圖1 蘆丁標準溶液和總黃酮提取液的吸收光譜Fig.1 The absorption spectrum of diagram of rutin solution and total flavonoids extracts from apple

2.1.3 蘆丁標準曲線的繪制

分別用吸量管準確移取0.00mL，0.50mL，1.50mL，2.50mL，3.50mL，4.50mL，5.50mL蘆丁溶液于七支50mL容量瓶中，先后加入1.00mL 5%的NaNO2;4.00mL 10%的Al(NO3)3;4.00mL 4%的NaOH，振蕩混勻;最后用75%乙醇定容，振蕩搖勻，靜置片刻。試劑空白為參比，在510nm處測定吸光度，吸光度對蘆丁濃度作圖，繪制標準曲線。由標準曲線計算回歸方程為A=－0.00853+12.6C，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.9991。

圖2 蘆丁溶液標準曲線Fig.2 The standard curve of rutin solution

2.2 蘋果果皮中總黃酮提取及定性實驗

2.2.1 蘋果果皮中總黃酮的提取

稱取1.0000g原料于錐形瓶中，加入20.0mL濃度為75%的乙醇溶解，放入65℃恒溫水浴鍋中浸提2h，過濾，用10mL 75%乙醇洗滌濾渣3次。將濾液與洗滌液合并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，最后用75%乙醇定容，即得總黃酮提取液，備用。

2.2.2 總黃酮提取液定性實驗

鹽酸－鋅粉反應(yīng):分別移取1.00mL總黃酮浸提液、蘆丁溶液于兩支小試管中，滴加幾滴濃鹽酸，少許鋅粉，振蕩，觀察。鋁鹽反應(yīng):分別移取1.00mL總黃酮浸提液、蘆丁溶液，滴加幾滴1%硝酸鋁溶液，振蕩，觀察。濃硫酸反應(yīng):分別移取1.00mL總黃酮浸提液、蘆丁溶液，滴加幾滴濃硫酸，振蕩，觀察。濃氨水反應(yīng):分別移取1.00mL總黃酮浸提液、蘆丁溶液，滴加幾滴濃氨水，振蕩，觀察。

2.2.3 定性實驗結(jié)果及分析

蘋果皮總黃酮浸提液和蘆丁溶液的顯色反應(yīng)結(jié)果如表1，蘋果皮浸提液與蘆丁的顯色反應(yīng)現(xiàn)象一致，說明昭通金帥蘋果皮中含有黃酮類化合物。

表1 總黃酮提取液與蘆丁標準溶液的顯色反應(yīng)Tab.1 Chromogenic reaction of flavonoids extracts and rutin solution

2.3 單因素實驗及結(jié)果分析

2.3.1 浸提溫度對總黃酮提取率的影響

分別稱取1.0000g蘋果皮粉末于五支錐形瓶中，固定料液比為1∶20(g/mL)，即用20mL濃度為75%乙醇，在溫度分別為45℃、55℃、65℃、75℃和85℃的恒溫水浴中浸提2h。過濾，用10～15mL 75%乙醇洗滌濾渣至少三次。合并濾液和洗滌液，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，最后用75%乙醇定容。浸提液的顯色反應(yīng)和吸光度的測定過程參考文獻［13］。做三組平行試驗，將吸光度平均值代入線性回歸方程，計算蘋果皮中總黃酮提取率。

圖3 浸提溫度對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effection of temperature on the extraction ratio of total flavonoids

浸提溫度對總黃酮提取率的影響如圖3所示:當浸提溫度低于65℃時，隨著浸提溫度升高，總黃酮提取率也逐漸增大。浸提溫度65℃，總黃酮提取率最高 (3.18%)，浸提溫度超過65℃，總黃酮提取率開始降低。蘋果果皮中總黃酮提取的較佳溫度為65℃。

2.3.2 浸提時間對總黃酮提取率的影響

分別準確稱取1.0000g蘋果果皮粉末于五支錐形瓶中，固定料液比為1∶20(g/mL)，即用20mL濃度為75%乙醇，在65℃的恒溫水浴中分別浸提1.0h，1.5h，2.0h，2.5h，3.0h。過濾，用10～15mL 75%乙醇洗滌濾渣至少三次。合并濾液和洗滌液，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，最后用75%乙醇定容。浸提液的顯色反應(yīng)和吸光度的測定過程參考文獻［13］。做三組平行試驗，將吸光度平均值代入線性回歸方程，計算蘋果皮中總黃酮提取率。

圖4 浸提時間對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effection of time on the extraction ratio of total flavonoids

浸提時間對總黃酮提取率的影響如圖4所示:當浸提時間小于2.0 h時，浸提時間越長，總黃酮提取率越高;浸提時間為2.0h時總黃酮提取率最高 (4.23%);當浸提時間超過2.0h后，延長浸提時間，總黃酮提取率開始降低。蘋果果皮中總黃酮提取的較佳浸提時間為2.0h。

2.3.3 提取劑濃度對總黃酮提取率的影響

分別準確稱取1.0000g蘋果果皮粉末于五支錐形瓶中，固定料液比為1∶20(g/mL)，即用20mL乙醇，在65℃的恒溫水浴中浸提2.0h，改變提取劑乙醇的濃度分別為55%，65%，75%，85%，95%。過濾，用10～15mL 75%乙醇洗滌濾渣至少三次。合并濾液和洗滌液，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，最后用75%乙醇定容。浸提液的顯色反應(yīng)和吸光度的測定過程參考文獻［13］。做三組平行試驗，將吸光度平均值代入線性回歸方程，計算蘋果皮中總黃酮提取率。提取劑濃度對總黃酮提取率的影響如圖5所示:當乙醇濃度較低時，總黃酮提取率隨乙醇濃度增大單調(diào)遞增;乙醇濃度超過75%，總黃酮提取率隨乙醇濃度增加而降低。蘋果果皮中總黃酮提取的較佳提取劑濃度為75%，總黃酮提取率最高 (6.3%)。

圖5 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effection of ethanol concentration on the extraction ratio of total flavonoids

2.3.4 料液比對總黃酮提取率的影響

分別準確稱取1.0000g蘋果果皮粉末于五支錐形瓶中，分別用10、15、20、25、30 mL濃度為75%的乙醇，在65℃恒溫水浴中浸提2.0h。過濾，用10～15mL 75%乙醇洗滌濾渣至少三次。合并濾液和洗滌液，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，最后用75%乙醇定容。浸提液的顯色反應(yīng)和吸光度的測定過程參考文獻［13］。做三組平行試驗，將吸光度平均值代入線性回歸方程，計算蘋果皮中總黃酮提取率。料液比對總黃酮提取率的影響如圖6所示:當料液比小于1∶20時，隨料液比增大，總黃酮提取率也逐漸增大;當料液比為1∶20時，測定總黃酮提取率最高 (5.6%);當料液比大于1∶20時，隨著料液比增加，總黃酮提取率反而下降。蘋果果皮中總黃酮提取的較佳料液比為1∶20。

圖6 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.6 Effection of solid－liquid ratio on the extraction ratio of total flavonoids

2.4 正交實驗及結(jié)果分析

基于上述的單因素實驗結(jié)果，選定浸提溫度、浸提時間、提取劑濃度和料液比四個單因素，每個因素設(shè)定三個水平，設(shè)計L9(34)表進行正交實驗，優(yōu)化蘋果皮中總黃酮浸提工藝的實驗條件。相應(yīng)地因素水平表和正交實驗結(jié)果分別見表2和表3。

表2 L9(34)正交實驗因素與水平設(shè)計Tab.2 Factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

表3 正交實驗結(jié)果Tab.3 The result of orthogonal experiment

正交實驗結(jié)果顯示，以總黃酮提取率為考察指標，乙醇浸提昭通金帥蘋果果皮中總黃酮最優(yōu)實驗條件組合是A2B1C3D1。即浸提溫度為65℃，浸提時間為1.5h，乙醇濃度為85%，料液比1∶15。在正交實驗所確定的最優(yōu)實驗條件下，測得的蘋果皮中總黃酮的最高提取率為5.63%。正交實驗選定的四個單因素對總黃酮提取率的影響主次關(guān)系為B(浸提時間)﹥A(浸提溫度)﹥C(提取劑濃度)﹥D(料液比)，浸提時間對總黃酮提取率影響最大，其次是浸提溫度，再次是提取劑濃度，料液比的影響最小。按照正交實驗所確定的最佳浸提工藝實驗條件做三組平行實驗，蘋果皮總黃酮的平均提取率為5.63%，驗證實驗結(jié)果見表4。

表4 蘋果中總黃酮的提取率Tab.4 Extraction ratio of total flavonoids in apple

2.5 蘋果果皮中總黃酮對羥自由基的清除活性研究

中的Fenton體系:在10mL比色管中依次加入2.00mL 9mmol/L的FeSO4，2.00mL 9mmol/L的水楊酸－乙醇，再分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL蘋果皮總黃酮浸提液，加入2.00mL 8.8mmol/L H2O2啟動反應(yīng)，最后加蒸餾水定容，在37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30min。以空白試劑作參比，在510nm處測吸光度。參考上述體系和反應(yīng)條件，不加H2O2，測蘋果皮總黃酮浸提液的本底吸收。做三組平行實驗，計算浸提液總黃酮對羥自由基的抑制活性:

A0為空白對照液吸光度;Ax為含浸提液的吸光度;Ax0為不加H2O2浸提液的本底吸光度。

以BHT(二丁基羥基甲苯)為對照，比較兩種抗氧化劑對·OH的清除活性。實驗結(jié)果如圖7所示。

圖7 總黃酮提取液和BHT對羥自由基清除活性比較Fig.7 Scavenging activity comparison of total flavonoids and BHT

羥自由基的清除活性對照試驗結(jié)果顯示蘋果皮中總黃酮浸提液對·OH有清除活性，且清除率隨總黃酮浸提液體積增加而增大，且總黃酮浸提液對·OH的清除活性高于相同濃度相同體積的BHT。

3.結(jié)論

本文選用乙醇浸提法提取昭通金帥蘋果果皮中的總黃酮，設(shè)計單因素實驗探究了浸提溫度、浸提時間、提取劑濃度、料液比對蘋果果皮中總黃酮提取率的影響，設(shè)計正交實驗得出蘋果果皮中總黃酮提取的較佳實驗條件為:浸提溫度65℃、浸提時間1.5h、乙醇濃度為85%、料液比為1∶15，在此條件下，總黃酮的提取率為5.63%。

賈金霞等測得兩種栽培方法培育出的同一品種蘋果果皮中總黃酮含量分別為2.3%和9.9%;李紅、張元湖等測得蘋果果皮中的總黃酮含量為3.66%。而本文測得昭通金帥蘋果果皮中的總黃酮含量為5.63%?？梢姡袭a(chǎn)地不同、培育方法不同，蘋果果皮中的總黃酮含量差異很大。

本文還初步探究了蘋果皮總黃酮浸提液對羥自由基的清除活性，與BHT的對照實驗結(jié)果顯示，總黃酮提取液對羥自由基的清除活性要高于相同濃度相同體積的BHT。

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