李建梅，祖里皮亞·塔來提，庫爾班尼沙·買買提，希爾艾力·吐爾遜（新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830049）

·藥物分析·

RP－HPLC法測(cè)定開西尼孜散劑中沒食子酸和鞣花酸的含量

李建梅，祖里皮亞·塔來提，庫爾班尼沙·買買提，希爾艾力·吐爾遜＊（新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830049）

目的 建立同時(shí)測(cè)定開西尼孜散劑中沒食子酸和鞣花酸含量的RP－HPLC方法。方法 色譜柱為Waters X－Bridge C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇－乙腈－2mL·L－1磷酸水溶液，梯度洗脫；流速為1.0mL·min－1；檢測(cè)波長為254nm。結(jié)果 沒食子酸和鞣花酸的線性范圍分別為0.132～0.792μg（r＝0.999 9）和0.108～0.648 2μg（r＝0.999 9），平均加樣回收率分別為99.3%和98.8%，方法精密度RSD分別為1.4%和1.7%（n＝6）。結(jié)論 該方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可為開西尼孜散劑質(zhì)量評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

沒食子酸；鞣花酸；反相高效液相色譜法；開西尼孜散劑

開西尼孜散劑是由芫荽籽、毛訶子、訶子肉、余甘子等5味藥材組成的復(fù)方制劑，具有清理血熱、止痛安神功效，用于各種異常膽液質(zhì)性頭痛、熱性心悸、惡心、目花、耳鳴等［1］。由于原劑型為顆粒劑，鑒于維藥傳統(tǒng)劑型的優(yōu)化工藝及應(yīng)用研究，對(duì)該顆粒劑進(jìn)行改劑型研究，為后期的劑型對(duì)比研究奠定基礎(chǔ)。本文就開西尼孜散劑進(jìn)行定量研究，處方中的多味藥材均含有沒食子酸和鞣花酸，本文采用HPLC法對(duì)該散劑中的沒食子酸和鞣花酸進(jìn)行含量測(cè)定，為開西尼孜散劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國Waters高效液相色譜儀及化學(xué)工作站（美國沃特斯公司）；Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器，Empower數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)；Milli－Q超純水純化系統(tǒng)（18MΩ，Millipore公司）；SGT7200HBT型超聲清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 沒食子酸對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用，批號(hào)：110831－200302）；鞣花酸對(duì)照品（北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司提供，供含量測(cè)定用，批號(hào)476－66－4）；開西尼孜散劑（由新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所藥劑研究室提供，批號(hào)20100210）；甲醇、乙腈均為色譜純；水為超純水；磷酸、乙酸（分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的沒食子酸與鞣花酸對(duì)照品適量，置于25mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.132和0.108mg·mL－1的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取開西尼孜散劑成品約3.0g，置于50mL的棕色量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液20mL，超聲處理（59kHz）30min，加體積分?jǐn)?shù)50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾；精密吸取2mL，置于10mL棕色量瓶中，以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液稀釋并定容，過濾，即得［2］。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱：Waters X－Bridge C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）－乙腈（B）－2mL·L－1磷酸水溶液（C）梯度洗脫：0～14min（4%～4%A，0%～0%B），14～15min（4%～30%A，0%～8%B），15～35min（30%～32% A，8%～10%B）；流速：1.0mL·min－1；檢測(cè)波長：254nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL［3－5］。理論板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)算不低于3 000，分離度不低于1.5。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC圖A.混合對(duì)照品；B.開西尼孜散劑樣品；1.沒食子酸；2.鞣花酸Fig.1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substances；B.Kaixinizi Pulvis samples；1.gallic acid；2.ellagic acid

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取上述沒食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（0.132mg·mL－1）、鞣花酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（0.108mg·mL－1）2.5mL，分別置于10mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋并定容得33μg·mL－1沒食子酸對(duì)照品溶液、27μg·mL－1鞣花酸對(duì)照品溶液，從中分別精密吸取4.0，8.0，12.0，16.0，20.0和24.0μL，分別注入液相色譜儀，以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［6］。沒食子酸的線性回歸方程：Y＝2 782 286.36 X－5 660.5，r＝0.999 9（n＝6）；鞣花酸的線性回歸方程：Y＝3 226 341.27 X－41 188.0，r＝0.999 9（n＝6）。結(jié)果表明，沒食子酸進(jìn)樣量在0.132～0.792μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；鞣花酸進(jìn)樣量在0.108～0.648 2μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取質(zhì)量濃度為13.20 μg·mL－1的沒食子酸和10.80μg·mL－1的鞣花酸混合對(duì)照品溶液15μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定峰面積，結(jié)果沒食子酸和鞣花酸峰面積的RSD分別為1.40%和1.71%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批開西尼孜散劑6份，按上述2.2.2項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定。結(jié)果沒食子酸和鞣花酸含量的RSD（n＝6）分別為1.30%和2.17%，說明該方法的重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品試液，室溫放置，分別于0，2，4，6，8和12h按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果沒食子酸和鞣花酸峰面積的RSD分別為0.87%和2.51%。結(jié)果表明，供試品溶液室溫放置12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法測(cè)定回收率。精密稱取同一批號(hào)的供試品9份，每份約0.05g，置于10mL量瓶中，分成3組，每組分別加入質(zhì)量濃度為0.132mg·mL－1的沒食子酸對(duì)照品溶液0.5，1.0和1.5mL，加入體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液適量超聲提取30min，定容，制備低、中、高3個(gè)不同質(zhì)量濃度的供試品溶液，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，測(cè)定，平均回收率為99.3%，RSD為1.4%。結(jié)果見表1。

表1 沒食子酸加樣回收率結(jié)果Tab.1 Results of gallic acid sample recovery experiments

精密稱取同一批號(hào)的供試品9份，每份約0.07g，放10mL量瓶中，分成3組，每組分別加入質(zhì)量濃度為0.108mg·mL－1的鞣花酸對(duì)照品溶液0.5，1.0和1.5mL，加入體積分?jǐn)?shù)50%甲醇適量，超聲10min，定容，制備低、中、高3個(gè)不同質(zhì)量濃度的供試品溶液，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，測(cè)定，平均回收率為98.8%，RSD＝1.7%。結(jié)果見表2。

表2 鞣花酸加樣回收率結(jié)果Tab.2 Results of ellagic acid sample recovery experiments

2.8 樣品測(cè)定 準(zhǔn)確稱取開西尼孜散劑樣品約3.0g，按2.2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，于樣品放置不同時(shí)間測(cè)定沒食子酸和鞣花酸峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，開西尼孜散劑樣品室溫放置時(shí)1g平均含沒食子酸2.01mg、含鞣花酸2.80mg。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of sample content determination

3 小結(jié)與討論

3.1 檢測(cè)波長的選擇 經(jīng)過全波長掃描結(jié)果，沒食子酸和鞣花酸分別在254和270nm波長處有最大吸收，為了在相同條件下同時(shí)檢測(cè)2種成分，縮小樣品中2種成分峰面積差別，最終選擇254nm作為檢測(cè)波長。

3.2 流動(dòng)相的選擇 對(duì)甲醇－2mL·L－1磷酸溶液、甲醇－2mL·L－1乙酸溶液、甲醇－乙腈－2mL·L－1磷酸溶液、乙腈－2mL·L－1磷酸溶液等多種不同比例的流動(dòng)相進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)甲醇－乙腈－2mL·L－1磷酸溶液梯度洗脫時(shí)分離效果最好，且出峰時(shí)間快，故選擇本系統(tǒng)為流動(dòng)相［5］。

3.3 提取方法的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)結(jié)果選擇甲醇作為提取溶劑，分別考察了體積分?jǐn)?shù)20%甲醇、50%甲醇和甲醇的超聲和回流的不同提取方式，并對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇超聲提取30min即可提取完全，供試品中2個(gè)主要成分可以達(dá)到較好的分離效果和提取率，因此，確定用該提取方法。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，樣品含量不宜過高，否則峰形易拖尾變形。

3.4 樣品放置時(shí)間考察 根據(jù)本課題研究需要，對(duì)樣品放置時(shí)間需進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)開西尼孜散劑樣品放置60d內(nèi)沒食子酸和鞣花酸含量均未見顯著性變化，認(rèn)為該散劑處方中2種成分的含量均較穩(wěn)定，質(zhì)量可控。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：維吾爾藥分冊(cè)［M］.烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：190.

［2］王勤，孫蕓.HPLC法測(cè)定鎖陽中沒食子酸和原兒茶酸的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2010，25（3）：190－192.

［3］汗克孜·吐爾遜，迪力努爾·艾合買提.HPLC法測(cè)定血寧安吉杷爾糖漿中沒食子酸的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2013，28（1）：38－39.

［4］希爾艾力·吐爾遜，曼爾丹·尼牙孜，庫爾班尼沙·買提卡思木，等.阿米樂努西達(dá)日蜜膏中沒食子酸的含量測(cè)定［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31（3）：350－352.

［5］張華，裴桂珍，李桂華，等.鞣花酸片劑的制備及其含量測(cè)定［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（13）：39－42.

［6］張雯麗，孫冬曉，董麗華.RP－HPLC法同時(shí)測(cè)定金錢草和廣金錢草中綠原酸、槲皮素和山柰酚的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2013，28（5）：486－488.

Simultaneous determination of gallic acid and ellagic acid in Kaixinizi Pulvis by RPHPLC

LI Jianmei，Zulpiya TALAT，Kurbannisa MATKASIMU，Xirali TURSUN＊（Key Laboratory of Traditional Uyghur Medicine Prescription of Institute of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine，Urumqi 830049，China）

Objective To simultaneously determine gallic acid and ellagic acid in Kaixinizi Pulvis.Methods An RP－HPLC method was developed.The separation was performed on a C18（250mm×4.6mm，5μm）column with a gradient elution system of methanol－acetonitrile－2mL·L－1phosphoric acid at a flow rate of 1.0mL·min－1.The detection wavelength was set at 254nm.Results The linear ranges of determination for gallic acid and ellagic acid were 0.132－0.792μg（r＝0.999 9），and 0.108－0.648 2 μg（r＝0.999 9），respectively.The average recoveries were 99.3%and 98.8%，respectively.The relative standard deviation of precision of the method were 1.4%and 1.7%（n＝6），respectively.Conclusion This method is simple，rapid，accurate and reliable for the quality control of Kaixinizi Pulvis.

gallic acid；ellagic acid；RP－HPLC；Kaixinizi Pulvis

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.008

R284.1

A

1004－2407（2015）01－0026－03

2014－07－21）

新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所項(xiàng)目（編號(hào)：XJYS1104－2011－01）

李建梅，女，助理研究員，碩士

＊通信作者：希爾艾力·吐爾遜，男，主任藥師