余彩霞 楊夢(mèng)華 徐婷 譚軍 汪才俠

1.河南省商城縣人民醫(yī)院內(nèi)三科，河南商城465350；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南新鄉(xiāng)453003

褪黑素對(duì)阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的影響

余彩霞1楊夢(mèng)華1徐婷1譚軍2汪才俠1

1.河南省商城縣人民醫(yī)院內(nèi)三科，河南商城465350；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南新鄉(xiāng)453003

目的觀察褪黑素對(duì)阿爾茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）小鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的影響。方法采用側(cè)腦室注射β-淀粉樣多肽（Aβ1-42）誘導(dǎo)AD小鼠模型，隨機(jī)分為兩組：生理鹽水對(duì)照組和褪黑素（melatonin，MT）治療組（MT處理組）。治療組予50 mg/（kg·d）褪黑素腹腔注射治療，每日1次，連續(xù)14 d；生理鹽水對(duì)照組分別予等體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)注射14 d。14 d后檢測(cè)各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，觀察海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞因子IL-1β和炎癥信號(hào)通路NF-κB-p65的檢測(cè)。結(jié)果褪黑素治療組與對(duì)照組比較，褪黑素組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力提高，小膠質(zhì)細(xì)胞活化受到抑制，炎癥細(xì)胞因子IL-1β分泌減少。結(jié)論褪黑素對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)表達(dá)有抑制作用，可能與其抑制NF-κB-p65有關(guān)。

阿爾茨海默??；β-淀粉樣多肽；褪黑素；炎癥反應(yīng)；炎癥信號(hào)通路

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s dementia，AD）是常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性的記憶障礙，逐漸失去語言和思考能力，直至記憶能力完全喪失。病理特征表現(xiàn)為老年斑的沉積、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失和神經(jīng)炎癥反應(yīng)[1-4]，且日趨增多，給社會(huì)帶來越來越沉重的負(fù)擔(dān)[5]。本研究自2010年12月～2013年12月采用單側(cè)側(cè)腦室注射Aβ1-42造成AD的小鼠模型，同時(shí)予褪黑素（melatonin，MT）處理，從炎癥細(xì)胞、炎癥因子和NF-κB炎癥信號(hào)通路等方面觀察MT對(duì)AD小鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的影響，探討MT抗AD腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的機(jī)制，為MT的臨床應(yīng)用提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

β-淀粉樣多肽（beta-amyloid，Aβ）購自美國Sigma公司，將Aβ溶于無菌生理鹽水，置37℃恒溫箱內(nèi)孵育7 d即為聚集態(tài)的Aβ。褪黑素（melatonin，MT）購自Sigma公司。MT注射液的配置：將MT以少量無水乙醇助溶，加生理鹽水致MT濃度為5 mg/mL，避光，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SAM-P8小鼠，5月齡，體重35～40 g，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號(hào)：SCXK（京）2002-0001。動(dòng)物自由攝食飲水，環(huán)境溫度18℃～22℃，濕度40%，安靜，人工晝夜（12/12 h，從7：00～19：00給足光線）。所有實(shí)驗(yàn)參照美國國家衛(wèi)生研究院關(guān)于保護(hù)和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)原則以及動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)的指導(dǎo)方針執(zhí)行。

1.3 動(dòng)物分組

先用側(cè)腦室注射Aβ的方法制備AD動(dòng)物模型小鼠，選用造模后的AD模型小鼠48只，隨機(jī)分為兩組：生理鹽水對(duì)照組（24只）和MT處理組（24只）。造模后第1天腹腔注射給藥，MT處理組予50 mg/（kg·d）褪黑素腹腔注射治療，連續(xù)14 d；生理鹽水對(duì)照組予等體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)注射14 d。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris水迷宮由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制，實(shí)驗(yàn)開始，由將兩組AD模型小鼠頭朝池壁放入水中，觀察并記錄動(dòng)物在60 s內(nèi)自入水到找到平臺(tái)所需要的時(shí)間為逃避潛伏期（escape latency），并記錄下動(dòng)物在水中的游泳軌跡。若動(dòng)物在60 s內(nèi)沒有找到平臺(tái)，人為將動(dòng)物引上平臺(tái)，潛伏期記為60 s，讓小鼠在平臺(tái)上休息10 s。空間探索實(shí)驗(yàn)（spatial probe test）：定位航行實(shí)驗(yàn)后，撤去平臺(tái)，助手將小鼠面向池壁從第一象限放入水中，記錄小鼠60 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.5 觀察指標(biāo)

兩組AD模型小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)用多聚甲醛灌注、固定、取腦，制作腦組織切片。通過免疫組化檢測(cè)測(cè)量?jī)山M海馬組織陽性染色細(xì)胞數(shù)、小膠質(zhì)細(xì)胞的面積百分比，應(yīng)用ELISA法觀察兩組海馬炎性因子IL－1水平，應(yīng)用Westem blot方法檢測(cè)兩組細(xì)胞核內(nèi)NF－κB－p65蛋白的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。水迷宮實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期用重復(fù)測(cè)量的多因素方差分析；水迷宮實(shí)驗(yàn)中的空間探索試驗(yàn)的穿越平臺(tái)次數(shù)用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響

連續(xù)治療14 d后，行Morris水迷宮檢測(cè)，MT處理組小鼠的逃避潛伏期較對(duì)照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（23．1±1．4）s vs（40．1±1．4）s，t=4．327，P＜0．01]。見圖1 A。穿越平臺(tái)次數(shù)較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（4．1±1．1）次vs（2．1±1．2）次，t=10．216，P＜0．01]。見圖1B。

2.2 褪黑素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

48只AD模型小鼠經(jīng)免疫組化后，對(duì)照組海馬組織陽性染色細(xì)胞密集，胞體較大。而MT處理組陽性細(xì)胞數(shù)少，陽性細(xì)胞面積較對(duì)照組減少30．1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（4．5±0．1）%vs（6．3±0．1）%，t=2．705，P＜0．05]。見圖2 A、B、E。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察褪黑素對(duì)Aβ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，MT處理組小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的面積百分比較對(duì)照組減少23．2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（4．1±0．2）%vs（5．7±0．2）%， t=2．463，P＜0．05]。見圖2 C、D、F。

2.3 褪黑素對(duì)IL-1β的影響

應(yīng)用ELISA法觀察褪黑素對(duì)Aβ誘導(dǎo)小鼠海馬炎性因子IL－1β的影響，結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，MT處理組小鼠海馬炎癥細(xì)胞因子IL－1β水平明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（62．2±1．2）%vs（101．1±1．3）%，t= 8．013，P＜0．01]，見圖3，說明褪黑素能夠降低Aβ誘導(dǎo)小鼠海馬炎性因子IL－1β的表達(dá)。

2.4 褪黑素對(duì)AD模型小鼠腦內(nèi)NF-κB炎癥信號(hào)通路的影響

圖1 MT處理組與對(duì)照組小鼠Morris水迷宮學(xué)習(xí)與記憶檢測(cè)結(jié)果比較

圖2 MT處理組與對(duì)照組小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞比較

NF－κB炎癥信號(hào)通路與炎癥細(xì)胞和炎癥因子IL－1β的分泌密切相關(guān)，應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)NF－κB－p65的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，MT處理組與對(duì)照組相比，細(xì)胞核內(nèi)NF－κB－p65顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（0．60±0．02）U vs（1．00±0．03）U，t=4．729，P＜0．01]。見圖4。

圖3 MT處理組與對(duì)照組IL-1β表達(dá)的比較

圖4 MT處理組與對(duì)照組NF-κB-p65表達(dá)的比較

3 討論

AD的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，Aβ的蓄積是AD病理發(fā)生過程中一個(gè)病理特征之一。實(shí)驗(yàn)證明聚集態(tài)的Aβ有神經(jīng)毒性作用。動(dòng)物側(cè)腦室Aβ注射是目前一種較好的誘導(dǎo)AD動(dòng)物模型的方法。1991年Flood等[6]向小鼠腦室內(nèi)注射Aβ，首次觀察到這些Aβ片段可以引起小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力障礙。相繼有許多實(shí)驗(yàn)室采用中樞注射Aβ的方法觀測(cè)到Aβ在腦內(nèi)的沉積，并伴有小鼠和小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶障礙[7]。提出Aβ腦內(nèi)注射可被用于AD的動(dòng)物模型，之后Aβ腦內(nèi)注射建立AD動(dòng)物模型的方法得到廣泛的應(yīng)用。

AD是進(jìn)行性的腦功能障礙，近年來，炎癥反應(yīng)在AD發(fā)生中的作用受到普遍關(guān)注，AD患者的尸檢報(bào)告顯示，患者的SP及其附近發(fā)現(xiàn)有大量激活的小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及炎癥反應(yīng)產(chǎn)物：如炎性細(xì)胞因子IL－1β等的高表達(dá)[8]。AD患者的血液和腦脊液中也發(fā)現(xiàn)有TNF－α和IL－1β水平升高。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)期服用非甾體類抗炎藥（NSAIDS）的人群中，AD的發(fā)病率明顯降低[9]，以上研究均表明，炎癥反應(yīng)在AD的發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用。

小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)與AD腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，有小膠質(zhì)細(xì)胞存在時(shí)，Aβ對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)元毒性作用更加明顯。抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活性則有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用?？寡最愃幬镌贏D治療中得到普遍關(guān)注，抗炎藥物可以延緩AD的病理進(jìn)程，推遲AD的發(fā)生[10]。因此，抗炎藥物的開發(fā)和利用對(duì)AD的預(yù)防和治療非常重要。小膠質(zhì)細(xì)胞膜上的受體可以與Aβ形成復(fù)合物而相互作用，其結(jié)果是引起膠質(zhì)細(xì)胞活化并分泌更多的炎性因子，導(dǎo)致炎癥損傷。

老年斑的沉積引起小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活，引起炎性細(xì)胞因子COX－2等基因表達(dá)，其中有NF－κB炎癥信號(hào)通路參與。NF－κB是活化細(xì)胞早期轉(zhuǎn)錄因子。NF－κB主要是由P65和P50蛋白亞基組成的同源或異源二聚體組成。細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，NF－κB與IκB結(jié)合，以非活性狀態(tài)形式存在于細(xì)胞漿中。外界致炎物質(zhì)刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后，在蛋白激酶作用下，IκB與NF－κB解離，IκB磷酸化，被蛋白酶小體降解，將NF－κB釋放出來變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，NF－κB炎癥信號(hào)通路在小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和分泌炎性細(xì)胞因子過程中發(fā)揮重要作用[11]。

有研究顯示，AD與海馬結(jié)構(gòu)的功能退化密切相關(guān)，海馬結(jié)構(gòu)是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，位于側(cè)腦室下角底及內(nèi)側(cè)壁，與情緒、學(xué)習(xí)、記憶、行為及免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[12]。邊緣系統(tǒng)包括海馬結(jié)構(gòu)、海馬旁回、齒狀回、扣帶回、乳頭體及杏仁核，這些結(jié)構(gòu)通過帕帕茲環(huán)相互聯(lián)系，使中腦、間腦和新皮質(zhì)結(jié)構(gòu)之間發(fā)生信息交換，其中海馬結(jié)構(gòu)是AD首要損傷的區(qū)域。1987年Maurizi[13]首先提出褪黑素（molatonin，MT）的缺失可能與AD發(fā)病有關(guān)。1997年Maurizi[14]又指出MT的減少可以解釋AD病理變化的區(qū)域性和神經(jīng)系統(tǒng)特異性分布等特征。實(shí)驗(yàn)和臨床研究都顯示，患者存在MT合成和分泌下降、節(jié)律紊亂等多方面的異常，AD患者缺乏MT正常的晝夜節(jié)律[15]。Liu等[16]研究發(fā)現(xiàn)老年人尤其是AD患者腦脊液中MT水平明顯減少。MT作為松果體分泌的一種激素，其抗炎作用是近幾年的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)免疫組化檢測(cè)示，AD模型組海馬小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，陽性細(xì)胞面積百分比增加。褪黑素治療組海馬陽性細(xì)胞面積百分比減少，結(jié)果表明側(cè)腦室注射Aβ1-42可激活腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，引起膠質(zhì)細(xì)胞增生和活化，炎癥細(xì)胞因子分泌增加。IL-1β在AD患者腦內(nèi)表達(dá)增高，并與AD的主要神經(jīng)病理改變的發(fā)生、發(fā)展直接相關(guān)。已有眾多研究提示抗炎藥物可延緩AD的發(fā)展和推遲AD的發(fā)生[10]。越來越多的研究表明，AD是一個(gè)慢性炎癥過程，在AD患者腦內(nèi)存在嚴(yán)重的免疫和炎癥反應(yīng)[17-19]，而褪黑素可以抑制炎癥細(xì)胞因子的分泌，減緩海馬結(jié)構(gòu)的退變[20]，提示褪黑素有抑制AD小鼠模型腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞增生和活化，從而抑制AD腦內(nèi)炎癥反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)，褪黑素能夠降低Aβ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB的表達(dá)并拮抗炎癥細(xì)胞因子IL-1β的釋放，因此，推測(cè)褪黑素拮抗Aβ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎性細(xì)胞因子分泌增加的分子機(jī)制可能與抑制NF-κB炎癥信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)，但是其確切的抗炎機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

[1]Srikanth V，Maczurek A，Phan T，et al．Advanced glycation endproducts and their receptor RAGE in Alzheimer＇s disease[J]．Neurobiol Aging，2011，32（5）：763－777．

[2]Marchesi VT．Alzheimer＇s dementia begins as a disease of small blood vessels，damaged by oxidative－induced inflammation and dysregulated amyloid metabolism：implications for early detection and therapy[J]．FASEB J，2011，25（1）：5－13．

[3]Gong CX，Lidsky T，Wegiel J，et al．Phosphorylation of microtubule－associated protein tau is regulated by protein phosphatase 2A in mammalian brain．Implications for neurofibrillary degeneration in Alzhe-imer＇s disease[J]．J Biol Chem，2000，275（8）：5535－5544．

[4]葉偉，胡祥友，周江寧，等．老年性癡呆癥患者及轉(zhuǎn)基因小鼠模型海馬部位老年斑的特征[J]．中國臨床康復(fù)，2006，（46）：170－171＋233．

[5]Alzheimer＇s Disease Association．2013 Alzheimer＇s disease facts and figures[J]．Alzheimers Demennt，2013，9（2）：208－245．

[6]Flood JF，Morley JE，Roberts E．Amnestic effects in mice of four synthetic peptides homologous to amyloid beta protein from patients with Alzheimer disease[J]．Proc Natl A-cad Sci USA，1991，88（8）：3363－3366．

[7]Nitta A，Itoh A，Hasegawa T，et al．beta－Amyloid proteininduced Alzheimer＇s disease animal model[J]．Neurosci Lett，1994，170（1）：63－66．

[8]Passos GF，F(xiàn)igueiredo CP，Prediger RD，et al．Involvement of phosphoinositide 3－kinase gamma in the neuro－inflammatory response and cognitive impairments induced by beta－amyloid 1－40 peptide in mice[J]．Brain Behav Immun，2010，24（3）：493－501．

[9]Breitner J C．NSAIDs and Alzheimer＇s disease：how far to generalise from trials[J]．Lancet Neurol，2003，2（9）：527．

[10]Galimberti D，Scarpini E．Inflammation and oxidative damage in Alzheimer＇s disease：friend or foe[J]．Front Biosci（Schol Ed），2011，3：252－266．

[11]Filipov NM，Seegal RF，Lawrence DA．Manganese potentiates in vitro production of proinflammatory cytokines and nitric oxide by microglia through a nuclear factor kappa B－dependent mechanism[J]．Toxicol Sci，2005，84（1）：139－148．

[12]Cheng XIR，Zhou WX，Zhang YX．The behavioral，patholgical and therapeutic featuers of the senescence－accelerated mouse prone 8 strain as an Alzheimer＇s disease animal model[J]．Ageing Res Rev，2014，13（1）：13－37．

[13]Maurizi CP．Dementia－the failure of hippocampal plasticity and dreams．Is there a preventative role for melatonin[J]．Med Hypotheses，1987，24（1）：59－68．

[14]Maurizi CP．Loss of intraventricular fluid melatonin can explain the neuropathology of Alzheimer＇s disease[J]．Med Hypotheses，1997，49（2）：153－158．

[15]Uchida K，Okamoto N，Ohara K，et al．Daily rhythm of serum melatonin in patients with dementia of the degenerate type[J]．Brain Res，1996，717（1－2）：154－159．

[16]Liu RY，Zhou JN，van HJ，et al．Decreased melatonin levels in postmortem cerebrospinal fluid in relation to aging，Alzheimer＇s disease，and apolipoprotein E－epsilon4/4 genotype[J]．J Clin Endocrinol Metab，1999，84（1）：323－327．

[17]Golde TE．Inflammation takes on Alzheimer disease[J]．Nat Med，2002，8（9）：936－938．

[18]王運(yùn)良，尹紅蕾，婁季宇，等．姜黃素對(duì)β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的老年性癡呆大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響[J]．中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2011，（19）：5578－5582．

[19]張亮，李金蓮，龐有旺．小膠質(zhì)細(xì)胞和炎癥作用參與老年癡呆癥的研究進(jìn)展[J]．神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2006，（5）：583－585．

[20]Ramirez RG，Vega RNM，Oikawa SJ，et al．Welatonin synergizes with citalopram to induce antidepressant－like behavior and to promote hippocampal neurogenesis in adult mice[J]．J Pineal Res，2014，56（4）：450－461．

The effect of melatonin on inflammation reaction in mice with alzheimer’s disease

YU Caixia1YANG Menghua1XU Ting1TAN Jun2WANG Caixia1
1.The Third Department of Internal Medicine,Shangcheng County People's Hospital in He'nan Province,Shangcheng 465350,China;2.Department of Neurology,the Third Hospital Affiliated Xinxiang Medical University,Xinxiang453003, China

Objectives To investigates the effect of melatonin（MT）on inflammation reaction in mice with alzheimer’s disease（AD）.Methods The mice of AD model induced by injection of beta-amyloid（Aβ1-42）were divided randomly into two groups：MT-treated group and vehicle-treated group.MT-treated group were treated with MT（50 mg/kg·day）, and vehicle-treated groupwere were treated with vehicle for 14 days.The learning and memory capacity were tested, and the changes of microglia,astrocytes,and the expression of IL-1β and NF-κB-p65 were observed in two groups. Results Compared with the control group,the learning and memory ability of melatonin treatment group mice increased, the activation of microglia was inhibited,and the secretion of inflammatory cytokines IL-1 beta decreased.Conclusion MT may inhibit Aβ-induced increase in inflammation reaction through a pathway associated with NF-κB-p65 inflammatory signaling pathway.

Alzheimer’s Disease；Beta-amyloid；Melatonin;Inflammation reaction；Inflammatory signaling pathway

R749.16

A

1673-9701（2015）27-0020-04

2015－06－23）