姚慧娟 姚慧敏 沈艷琳 陳 倫 黃曉會(huì) 李 平

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥學(xué)部，上海200092；2.通化師范學(xué)院吉林省長(zhǎng)白山藥用植物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林通化134002

氣相質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定東北山櫻桃果酒的香氣成分

姚慧娟1姚慧敏2沈艷琳1陳 倫1黃曉會(huì)1李 平1

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥學(xué)部，上海200092；2.通化師范學(xué)院吉林省長(zhǎng)白山藥用植物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林通化134002

目的采用發(fā)酵法制備東北山櫻桃果酒，利用氣相質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)東北山櫻桃果酒中的香氣成分進(jìn)行分析研究。方法采用二氯甲烷萃取東北山櫻桃果酒中的香氣成分，氣相毛細(xì)管柱色譜法進(jìn)行分離，質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行分析，峰面積歸一化法確定香氣成分的相對(duì)含量，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)輔助人工檢索來鑒定香氣成分的化學(xué)成分。結(jié)果從東北山櫻桃果酒中鑒定出11種化學(xué)成分，鑒定出的揮發(fā)性化學(xué)成分占揮發(fā)油總量的99.94%，主要成分有乙酸（2.10%）、乙酸乙酯（4.26%）、異戊醇（8.23%）、二乙二醇（58.82%）、苯乙醇（5.98%）、對(duì)羥基苯乙醇（1.78%）、棕櫚酸（15.48%）、鐮葉芹醇（1.27%）。結(jié)論東北山櫻桃果酒中香氣成分主要為高級(jí)醇類等化合物，還含有少量具有抗癌活性的鐮葉芹醇。

山櫻桃；果酒；香氣成分；氣相色譜-質(zhì)譜法

櫻桃屬于薔薇科落葉喬木果樹，果實(shí)色味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有大量的維生素、鈣、鐵等微量元素和多種人體所需氨基酸，《本草綱目》記載：“調(diào)中，益脾氣，令人好顏色，美志。止泄精、水谷痢”，《名醫(yī)別錄》記載：“櫻桃的根、莖、枝、葉、果均可入藥，性味甘溫，有調(diào)中益脾之功”。文獻(xiàn)研究證明櫻桃具有抗心力衰竭、治療腳氣和浮腫、活血通經(jīng)等功效［1］，Araújo等［2］研究證明櫻桃果酒具有抗氧化和清除自由基的作用，Toydemir等［3］和Lynn等［4］也證明櫻桃中的花色素提苷及苷元具有很強(qiáng)的抗氧化活性和抗感染作用。因此，櫻桃具有重要的食用和藥用價(jià)值。

東北山櫻桃Cerasus tomentosa（Thunb.）Wall.又稱毛櫻桃、山櫻桃、野櫻桃，屬于薔薇科落葉喬木果樹，廣泛分布于我國(guó)的華北、西北及東北等各地，東北野櫻桃具有壽命較長(zhǎng)、結(jié)果無休閑、果實(shí)成熟早、抗逆性強(qiáng)、易于繁殖等特點(diǎn)，是培育大櫻桃的好砧木［5］。東北山櫻桃成熟時(shí)顏色鮮紅，玲瓏剔透，味美形嬌，富含多種氨基酸、維生素及鐵元素，營(yíng)養(yǎng)豐富，醫(yī)療保健價(jià)值高，多汁而味甜，又有“含桃”的別稱［1］。將東北山櫻桃鮮果制成櫻桃果酒，可以提高產(chǎn)品的附加值。

果酒是以植物的果實(shí)為原料，經(jīng)過一定的工藝發(fā)酵制備而成的低酒精度飲料，該果酒香氣濃郁、營(yíng)養(yǎng)豐富，果酒中的香氣成分為果實(shí)發(fā)酵過程中形成的副產(chǎn)物，主要包括高級(jí)醇類、酯類、萜烯、縮醛、內(nèi)酯等成分，具有調(diào)節(jié)和促進(jìn)人體新陳代謝、血液循環(huán)、控制膽固醇水平和抗衰老等保健作用［6］，這些香氣成分也是影響果酒的口感和質(zhì)量的主要因素之一［7］。因此，在果酒的質(zhì)量控制及分析鑒評(píng)時(shí)，有必要對(duì)果酒中的香氣成分進(jìn)行成分分析。國(guó)內(nèi)外對(duì)果酒香氣成分的研究已經(jīng)取得了一定的成果［8-9］，但目前未見氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法測(cè)定東北山櫻桃果酒中香氣成分分析的相關(guān)報(bào)道。本研究組以東北山櫻桃果實(shí)為原料，利用發(fā)酵工藝制備東北山櫻桃果酒，采用GC-MS法對(duì)東北山櫻桃果酒香氣成分進(jìn)行成分分析，為研究東北山櫻桃果酒釀造過程及優(yōu)選釀酒工藝提供一定的科研依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 6890-5973型GC-MS聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；無水硫酸鈉、無水乙醚均為分析純，水為二次蒸餾水；櫻桃果實(shí)采自吉林省通化市（經(jīng)朱俊義教授鑒定為東北山櫻桃Cerasus tomentosa（Thunb.）Wall.的果實(shí)，葡萄酒酵母為法國(guó)生產(chǎn)，產(chǎn)品商標(biāo)為ACTIFLORE。

2 方法與結(jié)果

2.1 櫻桃果酒釀造工藝流程

東北山櫻桃果實(shí)→分選→清洗破皮→主發(fā)酵→澄清處理→過濾→調(diào)配→精濾→無菌灌裝→成品。

2.1.1 原材料處理選擇新鮮的東北山櫻桃成熟果實(shí)，粉碎機(jī)打碎，將果漿加入少量清水稀釋，篩出種子，100 kg果實(shí)加水定量至500 kg。處理過后的東北山櫻桃果肉、果皮及水混合液作為發(fā)酵的主要成分。

2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的調(diào)整采用蔗糖將發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖分含量調(diào)整到17%～20%，利用檸檬酸將培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至4～5。

2.1.3 酵母菌發(fā)酵將調(diào)整后的發(fā)酵培養(yǎng)基，置于發(fā)酵罐中，加入0.02%（體積比例）的亞硫酸進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)間為48 h，然后加入0.03%（重量比）的酵母菌，進(jìn)行酵母菌的發(fā)酵。發(fā)酵罐內(nèi)的溫度控制在24～26℃之間。主發(fā)酵前3 d為有氧發(fā)酵以期增加酵母菌數(shù)量，之后為厭氧的發(fā)酵，以期產(chǎn)生乙醇。當(dāng)乙醇濃度穩(wěn)定在10°左右時(shí)，主發(fā)酵停止，時(shí)間為15 d左右。

對(duì)東北山櫻桃果實(shí)酵母菌不同的發(fā)酵期，進(jìn)行了酵母菌添加劑量的發(fā)酵效果觀察。在相同成分的發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加0.01%、0.03%、0.05%的酵母菌。于24～26℃下控溫發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著酵母添加劑量的加大，其發(fā)酵速度也相應(yīng)加快。但過大的酵母添加劑量會(huì)促使酵母迅速的繁殖以及旺盛的呼吸作用，培養(yǎng)基中的糖分過多的被呼吸作用所消耗，但這并不利于酒精的積累。酵母添加劑量為0.03%，主發(fā)酵期第10～15天的最終酒精度最高，因而本實(shí)驗(yàn)選擇0.03%的酵母添加量為宜。

2.2 樣品制備

取剛釀造好的櫻桃果酒100 mL，分別用100、50、30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉脫水，減壓濃縮至1 mL，作為供試品溶液供GC-MS分析。

2.3 GC-MS的測(cè)定

2.3.1 色譜條件HP-5彈性石英毛細(xì)管色譜（0.25 mm× 25m×0.33 μm）；升溫的程序：初溫度100℃，維持10 min，之后以5℃/min升至250℃；汽化度230℃；進(jìn)樣量為1.0 μL；溶劑延遲3 min；載氦氣（He）流量為2 mL/min；分流比為20∶1。

2.3.2 質(zhì)譜條件離子源：電子轟擊（EI）；電子能量：70 eV；離子源溫度：200℃；接口溫度：230℃；發(fā)射電流：34.6 μA；電子倍增器電壓：1200 V；質(zhì)量掃描的范圍：m/z 20～500。

2.4 測(cè)定方法

取體積為1.0 μL的櫻桃果酒香氣成分樣品，用GC-MS聯(lián)用儀器進(jìn)行分析鑒定，根據(jù)系統(tǒng)分析得到總離子流圖，采用計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，并結(jié)合有關(guān)的質(zhì)譜圖文獻(xiàn)解析，來確認(rèn)東北山櫻桃果酒香氣成分中的各個(gè)化學(xué)成分，按峰面積歸一化法對(duì)香氣成分進(jìn)行定量分析，確定各化學(xué)成分在揮發(fā)油中的相對(duì)百分含量。

2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按“2.3”項(xiàng)下條件下，測(cè)得櫻桃果酒中香氣成分的總離子流色譜圖，見圖1。最后將確認(rèn)的東北山櫻桃果酒香氣成分中化學(xué)成分及所求得的各化學(xué)成分在揮發(fā)性成分中的相對(duì)百分含量列于表1。

圖1 櫻桃果酒香氣成分總離子流色譜圖

表1 櫻桃果酒香氣成分氣相質(zhì)譜聯(lián)用法分析結(jié)果

3 討論

東北山櫻桃成熟期早，柔軟多汁，但其耐貯性差，放置幾天就會(huì)腐爛，鮮食利用率低，而且由于果粒較小，其在市場(chǎng)上遠(yuǎn)不如大櫻桃受歡迎，果農(nóng)的采摘積極性不高，許多櫻桃果在成熟期由于采摘不及時(shí)，造成鮮果的落果及腐爛，資源遭到極大浪費(fèi)。將東北山櫻桃鮮果制成櫻桃果酒，可以提高產(chǎn)品的附加值，不僅可以提高資源的利用率，還可以提高果農(nóng)的生產(chǎn)積極性，帶動(dòng)?xùn)|北地方區(qū)域的經(jīng)濟(jì)。

東北山櫻桃憑其高含糖量和高可食率成為果酒加工的良好原料，其釀造過程中產(chǎn)生的香氣成分構(gòu)成了櫻桃果酒的香味。目前國(guó)內(nèi)外只對(duì)一些酸櫻桃加工品種和少數(shù)得甜櫻桃品種中的香氣成分進(jìn)行了相關(guān)研究，但對(duì)發(fā)酵法制備的櫻桃果酒香氣成分的研究較少［10-11］，尤其對(duì)東北山櫻桃果酒的香氣成分研究鮮有報(bào)道。在櫻桃果酒發(fā)酵過程中，溫度作為酵母菌生長(zhǎng)繁殖的重要條件直接影響果酒的質(zhì)量及酒精的生成量。酵母菌生長(zhǎng)繁殖最佳溫度為25℃左右，溫度過低時(shí)酵母菌無法進(jìn)行繁殖和代謝；而發(fā)酵的溫度過高時(shí)，酵母菌的繁殖力下降，易衰老和死亡，從而使發(fā)酵液易受雜菌侵染而影響品質(zhì)。在相同的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.03%酵母菌，24～26℃為東北山櫻桃果酒最適主發(fā)酵溫度。

櫻桃果酒香氣成分中有些低沸點(diǎn)的化合物具有極易揮發(fā)性，使櫻桃酒中香氣成分的定量研究比較困難，因此，必須采用靈敏度高、選擇性好的檢測(cè)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，GC-MS法在酒類分析上已得到廣發(fā)應(yīng)用［12］。因此，本研究采用發(fā)酵法制備東北山櫻桃果酒，利用溶劑萃取法對(duì)東北山櫻桃香氣成分進(jìn)行萃取，采用檢測(cè)較為靈敏的GC-MS法對(duì)東北山櫻桃果酒中的香氣成分進(jìn)行成分分析，最終成功實(shí)現(xiàn)了櫻桃果酒香氣成分的定性和定量分析。

本研究從櫻桃果酒香氣成分中共分離鑒定出11種化學(xué)成分，鑒定出的揮發(fā)性化學(xué)成分占揮發(fā)油總量的99.94%，其中相對(duì)含量較高的為乙酸（2.10%）、乙酸乙酯（4.26%）、異戊醇（8.23%）、二乙二醇（58.82%）、苯乙醇（5.98%）、對(duì)羥基苯乙醇（1.78%）、棕櫚酸（15.48%）和鐮葉芹醇（1.27%）等。結(jié)果顯示，櫻桃果酒香氣成分中的主要化學(xué)成分為高級(jí)醇類和酯類等，與文獻(xiàn)報(bào)道［13］較為一致，其中二乙二醇含量將近60%，為櫻桃果酒香氣成分的主要化學(xué)成分，也是產(chǎn)生果酒香氣的主要成分。同時(shí)東北山櫻桃香氣成分中還檢測(cè)到一定量的黃酮類化合物鐮葉芹醇等成分，鐮葉芹醇為胡蘿卜素中的一種化學(xué)成分，經(jīng)研究證明該成分具有一定的抗癌活性［14］。前言所述，櫻桃具有一定的抗心力衰竭、治療腳氣和水腫、活血通經(jīng)的功效，還具有很強(qiáng)的抗氧化活性和抗炎作用，而東北山櫻桃果酒香氣成分中還含有抗癌活性藥物鐮葉芹醇，為臨床腫瘤的治療研究提供一定的方向，由于研究資料有限，東北山櫻桃的抗癌功效尚需進(jìn)一步開發(fā)研究。

果酒香氣成分中化學(xué)成分復(fù)雜，主要有酯、醇、萜烯類、揮發(fā)性酚、縮醛、內(nèi)酯等，而且各組分濃度差別大，極性和沸點(diǎn)相差也很大，同時(shí)它們之間還存在復(fù)雜的累加、協(xié)同和抑制作用［15］，因此，研究分析東北山櫻桃果酒中的香氣成分，對(duì)優(yōu)質(zhì)東北山櫻桃酒質(zhì)量評(píng)價(jià)系統(tǒng)的建立具有重要的理論和實(shí)踐意義。

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Analysis of aroma components constituent in fruit wine of Cerasus tomen鄄tosa(Thunb.)Wall.by gas chromatography mass spectrometry

YAO Huijuan1YAO Huimin2SHEN Yanlin1CHEN Lun1HUANG Xiaohui1LI Ping1
1.Department of Pharmacy,Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200092,China;2.Jilin Key Laboratory of Changbai Mountain Medicinal Plants Research Laboratory of Tonghua Normal University,Jilin Province,Tonghua134002,China

ObjectiveTo produce Cerasus tomentosa(Thunb.)Wall.fruit wine by fermentation method and to analyze aroma components constituent in fruit wine of Cerasus tomentosa(Thunb.)Wall.by gas chromatography mass spectrometry(GC-MS).MethodsAroma components constituent in fruit wine of Cerasus tomentosa(Thunb.)Wall.were extracted by methylene chloride and were analyzed by capillary GC.The relative content of chemical components were calculated by peak area normalization method,the chemical components were identified by GC-MS.ResultsEleven components were identified,the main identified chemical components account for 99.94%of the total volatile components, including Acetic acid glacia(2.10%),Ethyl acetate(4.26%),3-Methyl-1-butanol(8.23%),Diethylene glycol(58.82%), Phenethyl alcohol(5.98%),4-Hydroxyphenethyl alcohol(1.78%),Palmitic acid(15.48%),1,9-Heptadecadiene-4,6-diyn-3-ol,(3S,9Z)-(1.27%).ConclusionThe main aroma components constituent in fruit wine of Cerasus tomentosa (Thunb.)Wall.are higheralcohol,and contain some 1,9-Heptadecadiene-4,6-diyn-3-ol with anticancer activity.

Cerasus tomentosa(Thunb.)Wall.;Fruit wine;Aroma components constituent;Gas chromatography-mass spectrometry

R262.7

A

1673-7210（2015)02（b)-0103-04

2014-11-14本文編輯：衛(wèi)軻）

吉林省教育廳“十一五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號(hào)：吉教科合字［2010］第342號(hào)）。

姚慧娟（1983-），女，碩士，主要從事中藥新藥和藥理研究方面的工作。