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        漢黃芩素對(duì)卵巢癌HO-8910細(xì)胞增殖及凋亡的影響

        2015-01-12 02:15:32陳麗君
        關(guān)鍵詞:素處理依賴性黃芩

        陳麗君 王 娟 李 佳 王 建

        1.陜西省渭南市富平縣醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西富平711700;2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西西安710004;3.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西西安710032

        漢黃芩素對(duì)卵巢癌HO-8910細(xì)胞增殖及凋亡的影響

        陳麗君1王 娟2李 佳3王 建3

        1.陜西省渭南市富平縣醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西富平711700;2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西西安710004;3.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西西安710032

        目的探討漢黃芩素對(duì)人卵巢癌HO-8910細(xì)胞增殖、凋亡的影響,并分析可能的作用機(jī)制。方法采用不同濃度(0、20、50、80、100、130 μg/mL)的漢黃芩素處理人卵巢癌HO-8910細(xì)胞,48 h后分別用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化,AnnexinⅤ/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化,Western blotting分析p21、cyclin B1、p53和Bax蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果隨著處理濃度的增加,漢黃芩素劑量依賴性地抑制人卵巢癌HO-8910細(xì)胞的增殖(P<0.05),同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞大量凋亡。進(jìn)一步分析證實(shí),漢黃芩素能夠劑量依賴性地下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin B1的表達(dá),同時(shí)上調(diào)p21的表達(dá)(P<0.05),提示漢黃芩素可通過(guò)抑制細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程來(lái)抑制細(xì)胞的增殖。此外,漢黃芩素還能顯著誘導(dǎo)p53通路的活化及其下游促凋亡分子Bax的表達(dá)(P<0.05);而用p53通路抑制劑PFT-α預(yù)處理能夠顯著性降低漢黃芩素誘導(dǎo)的促卵巢癌細(xì)胞的凋亡效應(yīng)(P<0.05)。結(jié)論漢黃芩素能通過(guò)抑制細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程及調(diào)控p53促凋亡通路的活化來(lái)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖,同時(shí)顯著誘導(dǎo)細(xì)胞大量凋亡,提示漢黃芩素可能具有一定的抗卵巢癌活性,從而為進(jìn)一步探討其作為臨床治療卵巢癌的潛在藥物奠定理論基礎(chǔ)。

        卵巢癌;漢黃芩素;增殖;凋亡;細(xì)胞周期

        漢黃芩素(wogonin,別名5,7-二羥基-8-甲氧基-2-苯基-4H-1-苯并呋喃-4-酮)是從中藥黃芩根及半枝蓮中提取的活性物質(zhì),具有抗病毒、抗菌、保護(hù)血管、降血脂及利膽、解痙等生物活性[1-4]。近年來(lái),漢黃芩素在抗腫瘤中的作用得到廣泛關(guān)注。研究表明,漢黃芩素能夠有效地抑制多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng),同時(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的大量凋亡[4-5]。但是,漢黃芩素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響及其機(jī)制尚不清楚。因此,本研究體外觀察漢黃芩素對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-891增殖及凋亡的影響,并探討相關(guān)的作用機(jī)制,從而為進(jìn)一步探討其在臨床中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        人卵巢癌HO-8910細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;胎牛血清和MTT購(gòu)自華美生物工程有限公司;p53抑制劑PFT-α購(gòu)自Calbiochem公司;AnnexinⅤ/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司;兔抗人p53、p21和Bax多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;兔抗人cyclin B1抗體和小鼠抗兔-HRP標(biāo)記抗體均購(gòu)自Cell Signaling公司。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人卵巢癌HO-8910細(xì)胞株置于含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。每1~2天換液1次,2~3 d傳代1次。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HO-8910細(xì)胞接種于24孔板,每孔200 μL,含1×105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞中分別加入20、50、80、100、130 μg/mL的漢黃芩素,培養(yǎng)48 h后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn),空白處理為空白對(duì)照組。用100 μg/mL的漢黃芩素處理細(xì)胞,48 h后用25 μmol/L的p53抑制劑PFT-α處理細(xì)胞,2 h后進(jìn)行細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。

        1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力不同濃度漢黃芩素處理細(xì)胞48 h后,向每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清;加入150 μL DMSO(二甲基亞砜),置于搖床上低速振蕩10 min,充分溶解結(jié)晶物;酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm處OD值。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A490值-空白調(diào)零組A490值)/(空白對(duì)照組A490值-空白調(diào)零組A450值)×100%

        1.2.3 AnnexinⅤ/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集預(yù)處理細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌3次后加入1 mL 1×AnnexinⅤ結(jié)合緩沖液,4℃1000 r/min離心10 min去上清;加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,隨后分別加入10 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI(5 μg/mL)進(jìn)行標(biāo)記,輕輕混勻;避光孵育30 min,將細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

        1.2.4 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)用0.05%胰蛋白酶消化細(xì)胞,PBS洗滌3次;200 μL預(yù)冷的裂解液裂解細(xì)胞,冰上放置20 min,4℃12 000 r/min離心10 min,取上清。樣品煮沸處理后,進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳;采用半干轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,用5%脫脂奶粉封閉,按照常規(guī)的方法加入兔抗人p21、cyclin B1、p53及Bax一抗和HRP標(biāo)記的小鼠抗兔的二抗。ECL底物顯色,觀察p21、cyclin B1、p53及Bax的表達(dá)水平。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);兩組間比較采用t檢驗(yàn);以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 漢黃芩素對(duì)HO-8910細(xì)胞增殖的影響

        MTT法分析顯示,與空白對(duì)照組相比,漢黃芩素對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-8910的生長(zhǎng)具有抑制作用,且隨著劑量的加大,細(xì)胞的生長(zhǎng)速率明顯降低,其中,80、100、130 μg/mL漢黃芩素作用48 h時(shí),細(xì)胞的存活率分別為(61.4±4.2)%、(55.8±5.8)%、(42.7±6.7)%,與空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

        圖1 漢黃芩素對(duì)HO-8910細(xì)胞增殖的影響

        2.2 漢黃芩素對(duì)HO-8910細(xì)胞凋亡的影響

        流式分析顯示,與空白對(duì)照組相比,漢黃芩素處理組中Q2和Q4區(qū)熒光強(qiáng)度不斷增加,表明漢黃芩素能夠誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞大量凋亡(圖2A)。定量分析表明,用50、100 μg/mL漢黃芩素處理后,細(xì)胞的凋亡率分別為(27.2±2.5)%和(45.1±3.8)%,與空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)(圖2B),提示漢黃芩素劑量依賴性地誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞的凋亡。

        2.3 漢黃芩素對(duì)HO-8910細(xì)胞周期蛋白cyclin B1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21表達(dá)的影響

        Western blotting分析表明,與空白對(duì)照組相比,漢黃芩素劑量依賴性地上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21的表達(dá),同時(shí)細(xì)胞周期蛋白cyclin B1的表達(dá)明顯下調(diào)(圖3A)。定量分析證實(shí),分別用50 μg/mL和100 μg/mL漢黃芩素處理48 h后,p21的表達(dá)水平分別上調(diào)至空白對(duì)照組的2.50倍和3.82倍(P<0.01);而cyclin B1的表達(dá)水平分別下降至空白對(duì)照組的0.78倍和0.52倍(P<0.05)(圖3B),表明漢黃芩素可劑量依賴性地抑制HO-8910細(xì)胞DNA的合成。

        2.4 漢黃芩素對(duì)p53通路的影響

        圖2 漢黃芩素對(duì)HO-8910細(xì)胞凋亡的影響

        圖3 Western blotting分析p21和cyclin B1蛋白表達(dá)水平

        結(jié)果證實(shí),100 μg/mL漢黃芩素處理48 h后,細(xì)胞中p53表達(dá)水平明顯增高,同時(shí)其下游促凋亡分子Bax蛋白的表達(dá)水平顯著性上調(diào)(圖4A);定量分析表明,與空白對(duì)照組相比,100 μg/mL漢黃芩素處理后p53和Bax的表達(dá)水平分別增加了3.8和2.7倍(P<0.05),提示漢黃芩素能夠誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞中p53通路的活化(圖4B)。進(jìn)一步機(jī)制分析表明,25 μmol/L的p53抑制劑PFT-α處理2 h后,漢黃芩素誘導(dǎo)的HO-8910細(xì)胞的凋亡率明顯下降,與漢黃芩素單獨(dú)處理組相比,下降了100%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4C)。

        圖4 漢黃芩素對(duì)p53通路的影響

        3 討論

        卵巢癌是一種致死率最高的常見(jiàn)惡性婦科腫瘤,具有較高的增殖及遷移速率[6-8]。傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療及綜合治療等方法雖然在卵巢癌患者的治療中得到廣泛應(yīng)用,但并不能提高晚期卵巢癌患者預(yù)后5年生存率,且伴隨有化療耐藥及嚴(yán)重的藥物毒副作用等缺點(diǎn)[9]。因此,尋求新型高效、低毒抗癌藥物成為卵巢癌治療研究的熱點(diǎn)之一。

        黃酮類化合物具有廣泛的抗炎、抗病毒、解熱等功效,越來(lái)越多的研究證實(shí),黃酮類化合物具有潛在的抗腫瘤特性[10-12]。漢黃芩素是一種典型的黃酮類化合物,具有來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn),可發(fā)揮抗感染、抗血栓和抑制腫瘤等功能[13-15]。研究證實(shí),漢黃芩素不僅能夠制黑素瘤細(xì)胞的侵襲,還可通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)通路發(fā)揮抗肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的功效[5,16]。但是,漢黃芩素對(duì)卵巢癌細(xì)胞生理特性的影響及其機(jī)制尚不清楚。

        本研究證實(shí),漢黃芩素可劑量依賴性地抑制卵巢癌細(xì)胞增殖,同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞大量凋亡。多項(xiàng)研究證實(shí),許多抗癌藥可通過(guò)阻斷癌細(xì)胞的細(xì)胞周期來(lái)抑制細(xì)胞的增殖進(jìn)程,進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)[17-20]。已知細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK能夠調(diào)控DNA的復(fù)制及有絲分裂過(guò)程,而p21作為CDK1的抑制劑,能夠阻止細(xì)胞向G2/M期的過(guò)渡,抑制DNA合成。細(xì)胞周期蛋白cyclin B1能夠與CDK1結(jié)合,觸發(fā)細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程。當(dāng)用漢黃芩素處理后,細(xì)胞中p21的表達(dá)水平顯著性增加,同時(shí)cyclin B1表達(dá)水平明顯下降,表明漢黃芩素能夠通過(guò)阻斷細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程來(lái)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。已知p53及其下游的促凋亡分子Bax在調(diào)控細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著重要作用。本研究證實(shí),漢黃芩素處理后,卵巢癌細(xì)胞HO-8910中p53的表達(dá)水平明顯增高,同時(shí)誘導(dǎo)p53下游促凋亡分子Bax表達(dá)的上調(diào)。進(jìn)一步分析表明,阻斷p53通路后,漢黃芩素誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡率明顯下降,提示漢黃芩素可能通過(guò)p53通路的活化來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此,本研究證實(shí)了漢黃芩素能夠通過(guò)抑制細(xì)胞周期進(jìn)程及促凋亡通路的活化來(lái)調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡,從而為進(jìn)一步討論其在卵巢癌治療中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。但是,漢黃芩素如何調(diào)控細(xì)胞周期及活化p53促凋亡通路的作用機(jī)制尚不清楚,還有待于進(jìn)一步研究。

        [1]Bak EJ,Kim J,Choi YH,et al.Wogonin ameliorates hyperglycemia and dyslipidemia via PPARα activation in db/db mice[J].Clin Nutr,2014,33(1):156-163.

        [2]Takagi R,Kawano M,Nakagome K,et al.Wogonin attenuates ovalbumin antigen-induced neutrophilic Airway inflammation by inhibiting Th17 differentiation[J].Int J Inflam,2014,14:571508.

        [3]Song X,Zhou Y,Zhou M,et al.Wogonin influences vascular permeability via Wnt/β-catenin pathway[J].Mol Carcinog,2013,[Epub ahead of print].

        [4]Zhang M,Liu LP,Chen Y,et al.Wogonin induces apoptosis in RPMI 8226,a human myeloma cell line,by downregulating phospho-Akt and overexpressing Bax[J].Life Sci,2013,92(1):55-62.

        [5]Chen XM,Bai Y,Zhong YJ,et al.Wogonin has multiple anti-Cancer effects by regulating c-Myc/SKP2/Fbw7α and HDAC1/HDAC2 pathways and inducing apoptosis in human lung adenocarcinoma cell line A549[J].PLos One,2013,8(11):e79201.

        [6]Chen T,Jansen L,Gondos A,et al.Survival of ovarian cancer patients in Germany in the early 21st century:a period analysis by age,histology,laterality,and stage[J].Eur J Cancer Prev,2013,22(1):59-67.

        [7]Matsuo K,Yoshino K,Hiramatsu K,et al.Effect of lymphovascular space invasion on Survival of stageⅠepithelial ovarian cancer[J].Obstet Gynecol,2014,123(5):957-965.

        [8]Lengyel E.Ovarian cancer development and metastasis[J]. Am J Pathol,2010,177(3):1053-1064.

        [9]Naora H,Montell DJ.Ovarian cancer metastasis:integrating insights from disparate model organisms[J].Nat Rev Cancer,2005,5(5):355-366.

        [10]林春蕾,郭傳勇.白藜蘆醇抗肝癌作用研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2013,10(6):22-24.

        [11]Lin Y,Yngve A,Lagergren J,et al.A dietary pattern rich in lignans,quercetin and resveratrol decreases the risk of oesophageal cancer[J].Br J Nutr,2014,27:1-8.

        [12]Tameda M,Sugimoto K,Shiraki K,et al.Resveratrol sensitizesHepG2 cells to TRAIL-induced apoptosis[J]. Anti-Cancer Drugs,2014,25(9):1028-1034.

        [13]LeeW,KuSK,BaeJS.Anti-inflammatoryeffectsofbaicalin,baicalein,and wogonin in vitro and in vivo[J].Inflammation,2014,[Epub ahead of print].

        [14]Ku SK,Bae JS.Antithrombotic activities of wogonin and wogonoside via inhibiting platelet aggregation[J].Fitoterapia,2014,98:27-35.

        [15]Zhao K,Song X,Huang Y,et al.Wogonin inhibits LPS-induced tumor angiogenesis via suppressing PI3K/Akt/ NF-κB signaling[J].Eur J Pharmacol,2014,737:57-69.

        [16]Zhao K,Wei L,Hui H,et al.Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting rasmedicated pathways[J].PLos One,2014,9(9):e106458.[17]Liu E,Kuang Y,He W,et al.Casticin induces human glioma cell death through apoptosis and mitotic arrest[J]. Cell Physiol Biochem,2013,31(6):805-814.

        [18]Casella ML,Parody JP,Ceballos MP,et al.Quercetin prevents liver carcinogenesis by inducing cell cycle arrest,decreasing cell proliferation and enhancing apoptosis[J]. Mol Nutr Food Res,2014,58(2):289-300.

        [19]Tian D,Narayanan B,Mazumder A,et al.Abstract B27:Tripterine induced cell cycle arrest and apoptosis is associated with modulation of PI3K-AKT-mTOR pathway in human pancreatic cancer cell[J].Cancer Prev Res,2013,6(11 Supplement):B27.

        [20]Guo H,Xu YM,Ye ZQ,et al.Curcumin induces cell cycle arrest and apoptosis of prostate cancer cells by regulating the expression of IκBα,c-Jun and androgen receptor[J].Pharmazie,2013,68(6):431-434.

        Effect of wogonin on the proliferation and apoptosis of ovarian carcinoma HO-8910 cells

        CHEN Lijun1WANG Juan2LI Jia3WANG Jian3
        1.Department of Obstetrics and Gynecology,Fuping County Hospital in Weinan City,Shaanxi Province,Fuping 711700,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of School of Medicine of Xi'an Jiaotong University,Shaanxi Province,Xi'an710004,China;3.Department of Obstetrics and Gynecology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Shaanxi Province,Xi'an710032,China

        ObjectiveTo explore the role and underlying molecular mechanism of wogonin on the proliferation and apoptosis of ovarian carcinoma HO-8910 cells.MethodsFollowing the stimulation with various doses of wogonin(0, 20,50,80,100,130 μg/mL)for 48 h,MTT colorimetry was used to detect cell proliferation rate.Cell apoptosis was analyzed using double staining with AnnexinⅤand propidium iodide(AnnexinⅤ/PI).The expression levels of p21, cyclin B1,p53 and Bax were assessed by Western blotting.ResultsWogonin dampened ovarian carcinoma HO-8910 cell proliferation and promoted the apoptosis rates in a dose-dependent manner(P<0.05).Moreover,wogonin dosedependently down-regulated the expression levels of cell cycle protein cyclin B1,as well as the up-regulation of p21 expression levels(P<0.05),suggesting that wogonin might inhibit cell growth by suppressing cell cycle.Additionally, an obvious increase in p53 and its downstream Bax was observed in HO-8910 cell stimulated with wogonin statistically (P<0.05).However,this up-regulation was dramatically attenuated when preconditioning with p53 inhibitor PFT-α(P<0.05).ConclusionWogonin can abrogate HO-8910 cell proliferation and enhance cell apoptosis by regulating cell mitosis and apoptosis-related p53 pathway,implying as potential suppressor for ovarian cancer.Therefore,this study will support its potential targets for further development of anti-ovarian cancer therapy.

        Ovarian cancer;Leptin;Proliferation; Apoptosis;Cell cycle

        R737.31

        A

        1673-7210(2015)02(b)-0004-05

        2014-11-05本文編輯:程銘)

        國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)81172458/H1621)。

        陳麗君(1980-),女,陜西富平人,碩士;研究方向:婦科腫瘤。

        王建(1962-),男,碩士,主任醫(yī)師;研究方向:婦科腫瘤。

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