尹立偉，楊春成，池玉杰

( 1.安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽安慶 246011；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040 )

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猴頭菌CB1染料脫色及其相關(guān)木質(zhì)素降解酶的研究

尹立偉1，2，楊春成1，池玉杰2*

( 1.安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽安慶 246011；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040 )

[目的]探索猴頭菌CB1木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)對(duì)4種染料脫色降解的研究。[方法]采用紫外/可見分光光度計(jì)，檢測(cè)猴頭菌木質(zhì)素降解酶活性及4種染料不同濃度的脫色率。[結(jié)果]猴頭菌可同時(shí)產(chǎn)生MnP和Laccase，但不產(chǎn)生LiP。隨著Mn2+的濃度變化，Mn2+對(duì)MnP的酶活性起到誘導(dǎo)/限制作用；猴頭菌在72 h對(duì)不同濃度的茜素紅和中性紅染料的脫色率分別為100.00%和68.75%，而5 mg/L濃度的剛果紅在24 h的最大脫色率為74.61%，5 mg/L結(jié)晶紫在72 h的最大脫色率為66.86%。[結(jié)論]猴頭菌的胞外酶液對(duì)不同濃度的茜素紅和中性紅染料表現(xiàn)為易脫色底物，剛果紅次之，結(jié)晶紫最難被脫色降解。

猴頭菌；木質(zhì)素降解酶；染料；脫色降解

隨著商品染料種類的增多，印染廢水排放量增加[1-2]，其所含有的高分子有機(jī)物組分復(fù)雜，有毒性，濃度及色度高，且可生化性低，難于被降解。常采用的物理法和化學(xué)法沒有生物降解法對(duì)染料及廢水的處理成本低，污染小，生物降解法具有較好的環(huán)境效益和經(jīng)濟(jì)效益。白腐菌(White-rot Fungi)具有優(yōu)良的脫色性能，在染料脫色和廢水處理等方面越來越引起重視[3]。白腐菌是一種能夠引起木材白色腐朽病的擔(dān)子菌，它可以在木質(zhì)素細(xì)胞腔內(nèi)產(chǎn)生一些胞外氧化酶系，主要包括3種酶：錳過氧化物酶(Manganese peroxidases/MnPs)[4]、漆酶(Laccases/Lac)[5]和木質(zhì)素過氧化物酶(Lignin peroxidases/LiPs)等。木質(zhì)素降解酶系及其他一些酶的協(xié)同作用[6-8]，在Mn(II)和H2O2存在時(shí)，能以催化氧化、還原等方式破壞染料的發(fā)色體系和不飽和共軛鍵，引發(fā)菌體外一系列的自由基反應(yīng)，促使底物氧化，致使白腐菌能夠降解不同結(jié)構(gòu)的有機(jī)污染物，最終進(jìn)行染料的脫色、降解和礦物化。白腐菌能夠耐受一些毒性很強(qiáng)的污染物且能降解不溶性化合物，所以白腐菌在處理廢水時(shí)不受污染物溶解性和毒性的限制[9]。在木質(zhì)素降解酶系中的錳過氧化物酶(MnPs)與木質(zhì)素過氧化物酶(LiPs)一樣，都具有一系列糖基化的血紅素過氧化物酶和相似的催化循環(huán)。MnPs可以氧化Mn2+為高度活性的Mn3+，被氧化的Mn3+由有機(jī)酸螯合劑所穩(wěn)定[10]，這些螯合物可滲透或擴(kuò)散離開酶活性中心，作為一種可擴(kuò)散的酚類化合物和一些染料復(fù)合物的氧化劑[11-12]。連小英等曾報(bào)道通過不同的培養(yǎng)方式對(duì)黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporum)的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶MnP的影響，對(duì)蒽醌染料酸性藍(lán) 45 進(jìn)行脫色降解[13]。而Pasti等的研究表明，MnP單獨(dú)作用同樣可以降解多種不同類型的污染物[14]。

染料的還原脫色能力及脫色速率除受到外界環(huán)境因素，還受內(nèi)部條件C源、N源、Mn2+濃度及染料濃度等因素，一些降解物對(duì)染料濃度有耐受極限。譚國(guó)民等曾報(bào)道白腐菌F3菌株Mn2+濃度添加20 mg/L時(shí)，脫色速率和脫色效果明顯提高，共培養(yǎng)6 d后對(duì)堿性品綠脫色率可達(dá)99.2%，添加量增加脫色速率加快，但添加量過高(100 mg/L)會(huì)起抑制作用，脫色率逐漸下降，生物量也隨之下降，菌體生長(zhǎng)和脫色均受到抑制[15]。該研究通過白腐真菌中的猴頭菌(H.erinaceum)分泌木質(zhì)素降解酶系對(duì)4種最為廣泛的偶氮染料、蒽醌染料、三苯基甲烷染料和雜環(huán)類染料進(jìn)行固/液體培養(yǎng)基的脫色處理，以期為今后研究猴頭菌木質(zhì)素酶系統(tǒng)的染料脫色和工業(yè)廢水處理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種猴頭菌菌株CB1采自長(zhǎng)白山，經(jīng)分離、純化后保藏于東北林業(yè)大學(xué)森林病蟲病理實(shí)驗(yàn)室內(nèi)-4 ℃冰箱。

1.2 主要試劑與儀器2，6-二甲氧基苯酚(2，6-dimethoxyphenol/2，6-DMP)、ABTS [2，2’-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]、VA(3，4-二甲氧基苯甲醇/藜蘆醇)都購(gòu)自sigma公司；茜素紅(Alizarin red)：分子式為C14H7NaO7S·H2O，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)站；中性紅(Neutral red)：分子式為C15H17ClN4，天津市大茂化學(xué)試劑廠；剛果紅(Congo red)：分子式為C32H22N6Na2O6S2，Amresco；結(jié)晶紫(Crystal violet)：分子式為C25H30N3Cl9H2O，天津光復(fù)，其余試劑均為分析純。紫外/可見分光光度計(jì)(Ultrospec 4300pro，Amersham)；精密酸度計(jì) pHS-2C：上海虹益儀器儀表有限公司。

1.3 產(chǎn)酶培養(yǎng)及酶活測(cè)定將生長(zhǎng)在PDA培養(yǎng)基上的猴頭菌菌株接種至250 ml裝有70 ml液體LNAS培養(yǎng)基(含Mn2+2.67×10-3mmol/L)的錐形瓶中，即礦物元素溶液中添加MnSO4·H2O，并加入2 g青楊(Populusussuriensis)木屑為產(chǎn)酶底物，分別采用ABTS法、2，6-DMP法和藜蘆醇(VA)法檢測(cè)猴頭菌酶液中木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)中Laccase、MnP和LiP的有無。產(chǎn)酶培養(yǎng)方式與酶活測(cè)定方法均按照參考文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。根據(jù)Mn2+的變化情況，在含Mn2+(濃度分別為0、2.67、26.7、200、400、600和2 000 μmol/L)，蛋白胨0.5%、吐溫80 0.5 g/L、pH 4.5的每個(gè)錐形瓶中加入5 ml滅菌的15%葡萄糖溶液。28 ℃靜止培養(yǎng)至3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 d，提取培養(yǎng)液即胞外酶液離心(13 200 r/min，室溫5 min)進(jìn)行木質(zhì)素降解酶活測(cè)定，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。計(jì)算產(chǎn)酶活性變化值并繪制出產(chǎn)酶活/時(shí)間曲線圖。

1.4 4種染料在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基的脫色將4種(茜素紅、中性紅、剛果紅、結(jié)晶紫)染料各稱取0.007、0.028、0.070、0.140 g加入100 ml去離子水，分別制備成終濃度為5、20、50和100 mg/L的液體染料。經(jīng)121 ℃高溫高壓滅菌的PDA固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上填加4種染料各5 ml，攪拌均勻后倒平皿以備脫色處理。將活化后的菌落用直徑0.5 cm 的打孔器沿菌落邊緣打孔，菌片倒置接入平板中心，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)。4種染料在固體培養(yǎng)基上的脫色效果一般均采用目視法測(cè)定，猴頭菌接種生長(zhǎng)13～15 d 后正常會(huì)長(zhǎng)滿平皿，以肉眼觀察菌株對(duì)4種不同染料濃度的脫色變化和菌絲的生長(zhǎng)情況。液體培養(yǎng)基的染料脫色一般采用分光光度計(jì)法測(cè)定脫色效果，當(dāng)4種染料的吸收峰處于最大時(shí)檢測(cè)吸光度值的變化。在LNAS液體培養(yǎng)基中Mn2+的濃度為600 μmol/L 并填加2 g木屑，pH為4.5，同樣設(shè)3組重復(fù)，用棉塞和牛皮紙封裝，121 ℃高溫高壓滅菌后接菌。將篩選出的菌株平板培養(yǎng)15 d 后，分別刮取3個(gè)平皿8 cm中的菌絲放入無菌水中勻漿2～3次，接種到液體培養(yǎng)基中，接種量5 ml。以不加染料的菌液為對(duì)照，于28 ℃、150 r/min，振蕩培養(yǎng)15 d，每瓶中分別加入5、20、50和100 mg/L濃度的剛果紅、結(jié)晶紫、中性紅、茜素紅4種不同染料開始檢測(cè)脫色效果。加入染料后利用紫外可見分光光度計(jì)在300～800 nm區(qū)間掃描，測(cè)量4種染料的最大吸收峰波長(zhǎng)和吸光度A0，以去離子水為對(duì)照。檢測(cè)0、1、12、24、36和72 h的脫色效果，并計(jì)算出脫色率。

1.5 4種染料的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制將4種染料分別配制成100 mg/L的母液，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 ml母液至6個(gè)試管中，分別用去離子水將6個(gè)試管稀釋至1 ml，配成濃度為0、20、40、60、80和100 mg/L的染料溶液。在染料各自的最大吸收峰處測(cè)定其吸光度Ai，以染料濃度C(mg/L)為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)i為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出4種染料的標(biāo)準(zhǔn)方程。

1.6 染料脫色率的計(jì)算方法采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行分析，在染料的最大特征吸收波長(zhǎng)下，測(cè)定降解前染料的吸光值A(chǔ)0，以不加染料的菌液為對(duì)照。再將特定濃度的染料加入到培養(yǎng)基中，脫色一段時(shí)間后測(cè)定吸光值A(chǔ)i。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將染料吸光值A(chǔ)0和Ai轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的染料濃度C0和Ci，染料的脫色率用如下公式計(jì)算[17]： 脫色率(%)=(C0-Ci)/C0×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 猴頭菌木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)及不同Mn2+濃度的MnP的檢測(cè)結(jié)果猴頭菌菌株CB1含Mn2+，2.67 μmol/L的液體LNAS培養(yǎng)基中加入2 g青楊木屑為產(chǎn)酶底物，在21 d的培養(yǎng)過程中，紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)310 nm處經(jīng)以藜蘆醇為底物的測(cè)定方法，未檢測(cè)到LiP的活性。而采用2，6-DMP法經(jīng)470 nm處檢測(cè)MnP在13 d達(dá)到最大分泌量，酶活力為45.56 U/L；以ABTS法經(jīng)420 nm處檢測(cè)Laccase在第9天達(dá)到最大分泌量，酶活力為61.85 U/L，表明猴頭菌在21 d內(nèi)可同時(shí)產(chǎn)生MnP和Laccase，但未產(chǎn)生LiP的活性(圖1a)。根據(jù)Mn2+對(duì)MnP的酶活性起到誘導(dǎo)作用，經(jīng)470 nm處檢測(cè)MnP在15 d的變化情況，在不含Mn2+的培養(yǎng)方式下，提取的酶液未檢測(cè)到MnP的活性；在Mn2+的濃度為26.7 μmol/L，提取的酶液中MnP的活性在15 d達(dá)到最大分泌量，酶活力為55.92 U/L；在Mn2+的濃度為200 μmol/L，提取的酶液中MnP的活性在15 d達(dá)到最大分泌量，酶活力為141.51 U/L；在Mn2+的濃度為400 μmol/L，提取的酶液中MnP的活性在15 d達(dá)到最大分泌量，酶活力為156.71 U/L；在Mn2+的濃度為600 μmol/L，提取的酶液中MnP的活性在15 d達(dá)到最大分泌量，酶活力為259.55 U/L；在Mn2+的濃度為2 000 μmol/L，提取的酶液中MnP的活性在15 d達(dá)到最大分泌量，酶活力為93.14 U/L(圖1b)，結(jié)果表明不同的Mn2+濃度培養(yǎng)方式變化是有規(guī)律的。在不含Mn2+的培養(yǎng)方式下，21 d均未檢測(cè)到MnP的活性變化，而Mn2+的濃度分別為26.7、200、400和600 μmol/L，MnP的活性都是在3 d之后產(chǎn)生，隨之逐漸升高，Mn2+的濃度在第15天達(dá)到最高。而Mn2+的濃度為2 000 μmol/L時(shí)，MnP的活性沒有Mn2+的濃度為400和600 μmol/L的活性高，表明Mn2+的濃度達(dá)到一定程度時(shí)，MnP的活性會(huì)下降。不同的Mn2+的培養(yǎng)方式對(duì)比表明，Mn2+是猴頭菌產(chǎn)生MnP的必要因子，在誘導(dǎo)MnP的產(chǎn)生過程中起著關(guān)鍵作用。

2.2 4種染料在固體培養(yǎng)基中的脫色猴頭菌菌株CB1以平皿培養(yǎng)的方式對(duì)濃度為5、20、50和100 mg/L的4種染料(茜素紅、中性紅、剛果紅、結(jié)晶紫)進(jìn)行脫色研究。在第15天時(shí)，生長(zhǎng)在PDA中未添加染料的菌絲生長(zhǎng)最好，菌絲已長(zhǎng)滿平板。同時(shí)菌株CB1對(duì)4種不同染料都具有較強(qiáng)的脫色能力。相比較而言，猴頭菌菌絲生長(zhǎng)狀況：染料濃度5 mg/L>20 mg/L>50 mg/L>100 mg/L，PDA>茜素紅>中性紅>剛果紅>結(jié)晶紫。菌株CB1對(duì)染料具有明顯的吸附作用，猴頭菌菌落在PDA上生長(zhǎng)呈白色，茜素紅的吸附使菌絲略呈粉紅色，中性紅的吸附使菌絲呈紅色，剛果紅的吸附使菌絲呈桔紅色，結(jié)晶紫的吸附使菌絲呈紫色。染料的濃度越低，吸附染料時(shí)菌絲的顏色越淺，相反，則顏色越深。染料濃度達(dá)到一定高度，菌絲停止生長(zhǎng)，脫色效果則差?？偠灾?種染料中菌株CB1對(duì)茜素紅的脫色效果最好，對(duì)中性紅的脫色效果中等，對(duì)剛果紅的脫色效果較差，對(duì)結(jié)晶紫最難對(duì)達(dá)到脫色效果，菌絲生長(zhǎng)緩慢。這在一定程度上也反映了白腐菌對(duì)4種合成染料降解性質(zhì)的差異，見圖 2。

2.3 4種染料的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果利用紫外可見分光光度計(jì)在300～800 nm區(qū)間掃描4種染料的吸收峰，觀察其最大吸收峰值及吸光度值：4種染料蒽醌類染料中茜素紅最大吸收波長(zhǎng)為436 nm，吸光度值為0.861；雜環(huán)類染料中性紅最大吸收波長(zhǎng)為520 nm，吸光度值為3.040；偶氮類染料中剛果紅最大吸收波長(zhǎng)為498 nm，吸光度值為2.637；三苯甲烷類染料中結(jié)晶紫最大吸收波長(zhǎng)為568 nm，吸光度值為3.621。4種染料在最大吸收峰處的濃度C/吸光度A標(biāo)準(zhǔn)曲線，茜素紅R2值為0.997 6，中性紅R2值為0.999 2，剛果紅R2值為0.998 5，結(jié)晶紫R2值為0.998 2，4種染料的試驗(yàn)數(shù)據(jù)與擬合函數(shù)之間都接近1，如圖3所示。

2.4 4種染料在液體培養(yǎng)基中的脫色效果經(jīng)過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)并根據(jù)染料脫色率計(jì)算出，茜素紅5 mg/L在12 h內(nèi)脫色率達(dá)到100%,茜素紅20 ～100 mg/L在24 h內(nèi)脫色率達(dá)到100%；中性紅5 mg/L在24 h內(nèi)脫色率達(dá)到100%，中性紅20 mg/L在36 h內(nèi)脫色率達(dá)到100%，中性紅50～100 mg/L在72 h 內(nèi)脫色率分別達(dá)到100%和68.75%；剛果紅5～100 mg/L 的脫色率分別為74.61%、67.55%、52.01%和42.86%；結(jié)晶紫5～100 mg/L在72 h內(nèi)脫色率分別為66.86%、61.67%、53.07%、50.2%。4種染料不同濃度的脫色率隨時(shí)間變化曲線見圖4。

3 結(jié)論與討論

對(duì)猴頭菌菌株CB1進(jìn)行的主要木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)檢測(cè)的結(jié)果表明，猴頭菌可同時(shí)產(chǎn)生MnP和漆酶，但不產(chǎn)生LiP，但并不表明猴頭菌沒有LiP基因，這還有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步研究其LiP酶活性。猴頭菌降解MnP酶性是在第15天達(dá)到最高，Laccase是在第9天達(dá)到最高，以后都迅速下降。在培養(yǎng)方式相同的情況下，MnP比Laccase的酶活力強(qiáng)，表明在降解木質(zhì)素的過程中MnP起著關(guān)鍵作用。在不添加Mn2+的培養(yǎng)方式下，MnP無活性變化。而隨著Mn2+濃度增加到600 μmol/L時(shí)，酶活力高達(dá)259.55 U/L，Mn2+濃度為2 000 μmol/L時(shí)，酶活力高達(dá)93.14 U/L，表明Mn2+達(dá)到一定程度時(shí)，MnP的酶活性反而會(huì)下降，對(duì)猴頭菌的菌絲生長(zhǎng)還具有抑制作用?？梢奙n2+是猴頭菌產(chǎn)生MnP的必要因子，對(duì)MnP的酶活性起到既誘導(dǎo)又抑制作用。通過酶活性的檢測(cè)，證明猴頭菌中MnP和Laccase是降解木質(zhì)素成分的主要降解酶系。

當(dāng)猴頭菌產(chǎn)生的木質(zhì)素降解酶活性達(dá)到最大時(shí)，將染料加入培養(yǎng)體系中進(jìn)行共培養(yǎng)，觀察染料降解脫色的情況。該試驗(yàn)所用的4 種染料涉及蒽醌類、三苯甲烷類、偶氮類、雜環(huán)類等多種化學(xué)結(jié)構(gòu)的染料，在猴頭菌固體培養(yǎng)基的色澤上分別呈現(xiàn)為粉紅色、紅色、桔紅色和紫色。從對(duì)染料的脫色作用上看，實(shí)際是生物吸附與生物降解的有機(jī)結(jié)合，在一定程度上染料結(jié)構(gòu)上的差異也影響著染料被該菌的吸附降解。猴頭菌中的木質(zhì)素降解酶液對(duì)染料的降解機(jī)制也作用于底物，它對(duì)不同結(jié)構(gòu)的染料產(chǎn)生分解效應(yīng)，培養(yǎng)液中添加的茜素紅和中性紅染料為該菌的良好脫色底物，剛果紅次之，結(jié)晶紫最難被降解。染料的高降解率主要?dú)w于真菌系統(tǒng)的N-去甲基作用，猴頭菌的胞外酶液對(duì)茜素紅4個(gè)濃度5～100 mg/L具有非常顯著的降解效果，降解徹底迅速；中性紅僅次于茜素紅的脫色效果；而剛果紅4個(gè)濃度中5 mg/L的脫色率在 24 h達(dá)到最高74.61%，隨后都開始下降；結(jié)晶紫4個(gè)濃度中5 mg/L的脫色率在72 h達(dá)到最高66.86%，但降解效果都不理想。在該體系中菌體分泌的胞外酶以及菌絲吸附

作用等都會(huì)起到脫色作用，由于猴頭菌的降解機(jī)制是胞外的酶解體系，分泌的MnP和Laccase難以比較不同酶作用上的差異。在白腐菌范圍內(nèi)，染料結(jié)構(gòu)與生物降解作用底物、培養(yǎng)環(huán)境及菌系等多種因素相關(guān)，今后應(yīng)考慮一些單因素試驗(yàn)，對(duì)培養(yǎng)的粗酶液做進(jìn)一步木質(zhì)素降解酶的分離純化，從而在印染和廢水處理方面發(fā)揮積極作用。

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Decolorzation of Deys byHericiumerinaceumCB1 and Its Ligninolytic Enzymes

YIN Li-wei1,2, YANG Chun-cheng1,CHI Yu-jie2*

(1.School of Life Science, Anqing Normal University, Anqing, Anhui 246011;2. Forestry School, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

[Objective] To explore the 4 kinds of dyes decolorization and degradation fromH.erinaceumCB1 ligninolytic enzymes. [Method] By using UV/visible spectrophotometer,H.erinaceumlignin degrading enzyme activity and 4 dyes decolorization rate of different concentration were detected. [Result] The results indicated that it could produce MnP and laccase simultaneously, but no LiP excreted. With the variation of concentration of Mn2+, indicating that the Mn2+ions on enzyme activity of MnP to induce /limit function; the different concentration alizarin red and neutral red dyes of decolorization rate reached 100.00% and 68.75%, and respectively, the highest deco lorizing rate were 74.61% and 66.86% on 5 mg/L congo red in 24 h, and 5 mg/L crystal violet in 72 h fromH.erinaceum. [Conclusion] The different concentration alizarin red and neutral red dyes performance for easy decolour substrate, and followed by congo red, the most difficult was the crystal violet decolorization degradation from extracellular enzyme liquid ofH.erinaceum.

Hericiumerinaceum; Ligninolytic enzymes; Dyes; Decolorization and degradation

國(guó)家自然科學(xué)

(30671700)；安徽省教育廳自然科學(xué)研究一般項(xiàng)目(AQKJ2014B008);安慶師范學(xué)院科研啟動(dòng)項(xiàng)目(044-K05000130030)。

尹立偉(1981-), 女, 黑龍江雙鴨山人, 講師, 博士,從事植物病理學(xué)、分子真菌學(xué)等教學(xué)與研究。*通訊作者，教授, 博士，博士生導(dǎo)師, 從事森林病理與菌物開發(fā)利用研究。

2015-02-09

S 181.3

A

0517-6611(2015)09-250-04