郭建華，趙健喬，曹 政

(1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 402460;2.重慶澳龍生物制品有限公司，重慶 402460)

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幾種芽孢桿菌共培養(yǎng)對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響

郭建華1，趙健喬1，曹 政2*

(1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 402460;2.重慶澳龍生物制品有限公司，重慶 402460)

[目的]為了研究芽孢桿菌的共發(fā)酵對(duì)蛋白酶產(chǎn)量的影響。[方法]對(duì)4株具有產(chǎn)蛋白酶能力的芽孢桿菌，通過菌株兩兩配伍發(fā)酵或三者配伍共發(fā)酵培養(yǎng)，分別檢測(cè)單一菌株發(fā)酵產(chǎn)物和不同菌株共發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白酶活性。[結(jié)果]枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌均具有一定的產(chǎn)蛋白酶能力，枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌共發(fā)酵培養(yǎng)48 h后蛋白酶活力有顯著提高。[結(jié)論]菌株之間的科學(xué)配伍在共發(fā)酵中可以顯著提高蛋白酶的活性。

芽孢桿菌；共發(fā)酵；蛋白酶

在飼糧的氨基酸不平衡、蛋白質(zhì)消化不良的情況下，飼糧中50%～70%的氮隨糞、尿排出體外，最終形成污染環(huán)境的氨、硫化氫等有臭、有害氣體。發(fā)酵床養(yǎng)豬是結(jié)合現(xiàn)代微生物發(fā)酵處理技術(shù)而提出的一種環(huán)保、安全、有效的生態(tài)養(yǎng)豬法[1]。豬糞中含有豐富的有機(jī)質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量較高，因而向發(fā)酵床接種產(chǎn)蛋白酶高的菌種，能有效地促進(jìn)有機(jī)物降解，加速豬糞腐熟進(jìn)程，還有利于消除致臭物質(zhì)，減輕對(duì)環(huán)境的污染[2]。所以，篩選產(chǎn)蛋白酶高的發(fā)酵床菌種，并且進(jìn)行合理的科學(xué)配伍，選出高產(chǎn)蛋白酶配伍方式具有很大的意義。

芽孢桿菌(Bacillaceae)是能形成芽孢(內(nèi)生孢子)的桿菌或球菌。它們對(duì)外界有害因子抵抗力強(qiáng)，分布廣，存在于土壤、水、空氣以及動(dòng)物腸道等處?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtiliis)、納豆芽孢桿菌(Bacillussubtiliisnatto)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)已被廣泛制作成酶制劑，用于改善動(dòng)物腸道微生物菌群組成，并且產(chǎn)生蛋白質(zhì)酶以促進(jìn)飼糧的消化，彌補(bǔ)體內(nèi)內(nèi)原蛋白酶的不足[3-4]。目前的酶制劑有的是單一的菌群，有的是各種細(xì)菌的復(fù)合制劑，但是各種菌群混合發(fā)酵時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)情況和酶學(xué)特點(diǎn)目前未見報(bào)道。

共培養(yǎng)(Co-culture)是指利用兩種或兩種以上的微生物同時(shí)或有先后的加入培養(yǎng)，有效提高資源的利用率，并獲得較高產(chǎn)量的發(fā)酵方法。共發(fā)酵技術(shù)被廣泛用于污水處理、沼氣生產(chǎn)、土壤修復(fù)以及傳統(tǒng)食物的生產(chǎn)。與單一菌株發(fā)酵相比，不同微生物之間的相互作用可以讓共發(fā)酵獲得以外的效果[5]。筆者研究了幾種常見的芽孢桿菌不同組合配比培養(yǎng)條件下細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，同時(shí)研究不同發(fā)酵組合對(duì)生產(chǎn)蛋白酶活性的影響，以獲得最適細(xì)菌生長(zhǎng)、產(chǎn)蛋白酶最多的菌群組合及其比例，為研究、開發(fā)相關(guān)微生物制劑產(chǎn)品提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種的活化與培養(yǎng)條件將實(shí)驗(yàn)室保存的枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌的菌種劃斜面37 ℃培養(yǎng)24 h。供試菌株均采自榮昌縣某零排放養(yǎng)豬場(chǎng)墊料。培養(yǎng)基[3]組成為：1%葡萄糖、0.55%酵母膏、0.5%蛋白胨、0.2%KH2PO4、1%Na2CO3、0.2%MgSO4·7H2O，調(diào)整pH 8.0。

1.2 產(chǎn)蛋白酶菌株的配伍分別選取具有產(chǎn)蛋白酶能力菌株活化12 h作為種子液按4%的接種量，兩兩共發(fā)酵或三者共發(fā)酵接入裝有20 ml液體培養(yǎng)基的50 ml三角錐瓶中(各菌株等量接種)，置37 ℃ 160 r/min進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至24、48 h時(shí)取發(fā)酵液，測(cè)定蛋白酶活性，與菌株單獨(dú)發(fā)酵的蛋白酶活性進(jìn)行比較。

1.3 蛋白酶活力測(cè)定將培養(yǎng)了24、48 h的各菌株發(fā)酵液于4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，取上清液，即為粗酶液。粗酶液蛋白酶活力測(cè)定、蛋白酶活力計(jì)算方法、酶活力單位的定義均根據(jù)文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一菌株發(fā)酵蛋白酶活性將分離、純化后得到的純種菌株按4%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行菌株單獨(dú)發(fā)酵培養(yǎng)，置37 ℃160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)后，在培養(yǎng)至24、48 h時(shí)提取粗酶液，測(cè)定酶活力。由表1可知，實(shí)驗(yàn)室所保存的4種芽孢桿菌發(fā)酵液均有蛋白酶活性，發(fā)酵24 h內(nèi)4種芽孢桿菌的蛋白酶活性無顯著性區(qū)別，48 h后枯草芽孢桿菌與納豆芽孢桿菌的蛋白酶活性顯著高于地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。

2.2 不同菌株兩兩共發(fā)酵蛋白酶活性將菌株兩兩混合進(jìn)行共發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵24、48 h的蛋白酶活性。由表2可知，對(duì)菌株兩兩共發(fā)酵24 h后，枯草芽孢桿菌與納豆芽孢桿菌發(fā)酵液的蛋白酶活性在0.05水平顯著高于其他組合，發(fā)酵48 h后它們的蛋白酶活性與其他組相比差異在0.01水平顯著。

表1 單一菌株發(fā)酵產(chǎn)物酶活檢測(cè) U/ml

發(fā)酵時(shí)間∥h枯草芽孢桿菌納豆芽孢桿菌地衣芽孢桿菌蠟樣芽孢桿菌247.56±0.549.21±0.946.35±0.176.25±0.404812.28±0.40*18.56±0.80**7.48±0.267.32±0.14

注：表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)；*P<0.05；**P<0.01。

表2 兩兩混合發(fā)酵產(chǎn)物蛋白酶酶活檢測(cè) U/ml

發(fā)酵時(shí)間h枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌納豆芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌2414.1±0.36*8.96±1.268.42±0.8810.1±0.5710.2±0.336.94±0.424823.3±0.58**12.5±0.4111.4±0.7116.3±0.5115.9±0.688.06±0.63

注：表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)；*P<0.05；**P<0.01。

2.3 3種菌株共發(fā)酵蛋白酶活性選取3種純化后的菌株進(jìn)行混合發(fā)酵培養(yǎng)，置于37 ℃ 160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)后，在培養(yǎng)至24、48 h時(shí)提取粗酶液，測(cè)定酶活力。由表3可知，發(fā)酵24、48 h的結(jié)果差異不顯著，枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌發(fā)酵液與枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的發(fā)酵液在0.05水平顯著高于納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液的蛋白酶活性。

表3 3種芽孢桿菌共發(fā)酵酶活檢測(cè) U/ml

發(fā)酵時(shí)間h枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌2413.57±0.7013.32±0.698.86±0.224815.40±0.48*14.98±0.60*10.12±0.87

注：表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)；*P<0.05。

3 結(jié)論與討論

芽孢桿菌被廣泛用于零排放養(yǎng)殖場(chǎng)墊料中，也被廣泛用于微生態(tài)制劑，作為改善腸道微生物的益生菌。所以，研究芽孢桿菌各種生理生化特性對(duì)更好地應(yīng)用益生菌具有重要的理論與實(shí)踐意義。該研究對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中最常見的幾種芽孢桿菌進(jìn)行各種組合共發(fā)酵[7-8]，旨在揭示產(chǎn)蛋白酶效率最高的組合，為生產(chǎn)實(shí)踐提供理論指導(dǎo)。

研究中，在發(fā)酵培養(yǎng)24、48 h后，單一菌株發(fā)酵液中納豆芽孢桿菌蛋白酶活性最大，枯草芽孢桿菌次之，地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌最小。在兩兩發(fā)酵試驗(yàn)中，共發(fā)酵24 h后蛋白酶產(chǎn)量均比單一發(fā)酵有所提高，其中枯草芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌混合后產(chǎn)量增加顯著，其他五組雖有所增加但增加效果不顯著。在兩兩發(fā)酵48 h后，蛋白酶產(chǎn)量比24 h后有所增加，特別是枯草芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌共發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶量顯著高于其他組合。三種芽孢桿菌共發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶量普遍遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于兩兩混合發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶量。由此可知，在產(chǎn)蛋白酶角度上，三種芽孢桿菌共發(fā)酵不適宜被應(yīng)用到實(shí)踐生產(chǎn)中去。

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Influence of SeveralBacillusCo-fermentation on Protease Activity

GUO Jian-hua1, ZHAO Jian-qiao1, CAO Zheng2*

(1. Department of Veterinary Medicine, Southwest University, Rongchang, Chongqing 402460; 2. Chongqing Auleon Biologicals Company Limited，Rongchang, Chongqing 402460)

[Objective] The research aimed to study the influence of severalBacillusco-fermentation on protease yield. [Method] FourBacillussp. who were capable to produce protease were adopted. Through pairwise compatibility fermenting or three strains of fermentation cultivation compatibility，the protease activities were determined together with single strains of fermented products. [Result]Bacillussubtilin,Bacillusnatty,BacilluslicheniformisandBacilluscereushaveall possessed production protease ability. The highest protease activity was achieved when fermentation withBacillussubtilinandBacillusnattyafter 48 h. [Conclusion]Appropriate co-fermentation could significantly improve the protease production activity.

Bacillus；Co-fermentation；Protease

西南大學(xué)科研基金資助(08BSr04)。

郭建華(1977-)，男，江西于都人，副教授，博士，從事微生物資源開發(fā)與分子生物學(xué)研究工作。*通訊作者，研究員，博士，從事微生物分子生物學(xué)研究。

2015-02-09

S 154

A

0517-6611(2015)09-011-02