翟栓柱，楊葳，嚴(yán)俊，劉娟娟，郁彭，周澤奇

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457;2.天津市醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心，天津300070)

一種單克隆多抗體ELISA測(cè)定降鈣素原方法的建立及其臨床價(jià)值的探討

翟栓柱1，楊葳2，嚴(yán)俊1，劉娟娟1，郁彭1，周澤奇1

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457;2.天津市醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心，天津300070)

降鈣素原;單克隆抗體;雙抗體夾心法;快速檢測(cè)

自20世紀(jì)90年代起，降鈣素原(procalcitonin，PCT)作為一種生物標(biāo)志物逐漸進(jìn)入臨床應(yīng)用，臨床價(jià)值越來(lái)越被認(rèn)可。PCT的含量反映了全身性細(xì)菌感染的存在和嚴(yán)重程度[1]，同時(shí)它的升高或降低直接反映疾病惡化或好轉(zhuǎn)的趨勢(shì)[2]，也可用于對(duì)治療結(jié)果的評(píng)價(jià)以及指導(dǎo)抗菌藥物的使用[3]，對(duì)于細(xì)菌性感染的標(biāo)志性高于其他生物標(biāo)志物。但由于檢測(cè)方法的不同，試驗(yàn)的敏感性和特異性各不相同，甚至使PCT失去生物標(biāo)志功能。本研究創(chuàng)新采用單克隆多抗體建立PCT雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)體系，并初步評(píng)價(jià)其臨床應(yīng)用價(jià)值。

一、材料和方法

1.臨床樣本樣本收集自山東省胸科醫(yī)院，確定Cut-off值所用200例陰性樣本為正常人體檢樣本，60例陽(yáng)性樣本通過(guò)血清學(xué)臨床檢測(cè)、血液細(xì)菌培養(yǎng)等確認(rèn)細(xì)菌感染，患者年齡為5～60歲，男女性別隨機(jī)抽取。219例樣本通過(guò)法國(guó)生物梅里埃VIDAS PCT試劑盒檢測(cè)確定陰陽(yáng)性，患者年齡為7～72歲，男女性別隨機(jī)抽取。

2.試劑牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)購(gòu)自Amresco公司，PCT全長(zhǎng)抗原、PCT單克隆抗體、PCT酶標(biāo)抗體由丹娜(天津)生物科技有限公司提供，酶標(biāo)板購(gòu)自天津市優(yōu)萬(wàn)興生物技術(shù)有限公司。其它試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

3.抗體選擇及反應(yīng)條件優(yōu)化混合單克隆多抗體預(yù)試驗(yàn)的單克隆多抗體，即多種單克隆抗體混合物，比單個(gè)單克隆抗體具有更高的檢測(cè)敏感性，目前擁有針對(duì)PCT N端結(jié)合位點(diǎn)的多個(gè)單克隆抗體以及針對(duì)PCT C端結(jié)合位點(diǎn)的多個(gè)單克隆抗體，并且其已使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記。首先，分別配制單克隆多抗體的包被液，然后將其等量混合，在4℃下過(guò)夜包被，包被量為200 ng/well，包被液為磷酸鹽緩沖液;向每孔加入100 μL PCT抗原梯度稀釋液，37℃溫育30 min，洗滌拍干，分別加入多個(gè)單克隆抗體的酶標(biāo)抗體，37℃溫育30 min，洗滌拍干，加入顯色底物溶液，37℃溫育15 min，加入2 mol/L硫酸進(jìn)行終止，然后放入酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度(A)450nm讀數(shù)。根據(jù)結(jié)果選擇驗(yàn)證單克隆抗體的配對(duì)效果。

4.雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立根據(jù)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，選擇最優(yōu)試驗(yàn)條件，將PCT標(biāo)準(zhǔn)品按照10、5、2、1、0.5、0.25 ng/mL濃度配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最佳包被體系、反應(yīng)時(shí)間體系和酶標(biāo)抗體工作濃度建立人PCT雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。以PCT標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以A450nm值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，以P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.雙抗體夾心ELISA檢測(cè)體系的建立及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，最優(yōu)包被緩沖液為磷酸鹽緩沖液，最優(yōu)包被量為200 ng/well，最優(yōu)包被條件為4℃過(guò)夜，最優(yōu)封閉液為含3%BSA的磷酸鹽緩沖液。混合酶標(biāo)抗體工作濃度為1∶5 000，反應(yīng)體系為一步法，反應(yīng)時(shí)間10 min，顯色時(shí)間10 min。根據(jù)最優(yōu)試驗(yàn)條件建立ELISA檢測(cè)體系，在酶標(biāo)儀A450nm下讀數(shù)。以PCT標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以A450nm值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y= 0.187 1X+0.025 3，R2=0.999 8。

2.Cut-off值確定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果計(jì)算檢測(cè)抗原的濃度，通過(guò)檢測(cè)200名正常人樣本，取95%可信區(qū)間的抗原濃度值為Cut-off上限:+ 2s=0.12+2×0.06=0.25，通過(guò)檢測(cè)60例陽(yáng)性患者樣本，取95%可信區(qū)間的抗原濃度值為Cutoff值下限:-2s=1.75-2×0.63=0.50，抗原的濃度值0.25～0.50 ng/mL之間為疑似患者。

3.敏感性和特異性分析本研發(fā)產(chǎn)品檢測(cè)的樣本數(shù)量為219例，法國(guó)生物梅里埃VIDAS PCT試劑盒檢測(cè)其中陽(yáng)性樣本73例，陰性樣本146例。73例PCT抗原陽(yáng)性樣本中，本研發(fā)產(chǎn)品結(jié)果有68例為陽(yáng)性，5例為疑似。146例PCT抗原陰性樣本中，本研發(fā)產(chǎn)品結(jié)果143例為陰性，3例為疑似。見(jiàn)表1。

表1 臨床樣本PCT檢測(cè)對(duì)比結(jié)果

根據(jù)計(jì)算得到，本研發(fā)產(chǎn)品的敏感性為93.2%(68/73)，特異性為97.9%(143/146)。以敏感性為縱坐標(biāo)，(1-特異性)為橫坐標(biāo)繪制曲線，曲線下面積越大，說(shuō)明診斷準(zhǔn)確性越高。將上述數(shù)據(jù)進(jìn)行受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析，得到圖1的ROC曲線。ROC曲線下面積達(dá)0.991，說(shuō)明本體系的檢測(cè)性能優(yōu)越，有較高準(zhǔn)確性。同時(shí)，從上述結(jié)果我們還可以看到，本研發(fā)試劑盒具有更好的檢測(cè)敏感性、準(zhǔn)確度，能夠更好地區(qū)分患者PCT抗原的陰性、陽(yáng)性和疑似，從而可為臨床提供準(zhǔn)確的診療依據(jù)。

圖1 本研發(fā)產(chǎn)品檢測(cè)PCT的ROC曲線

三、討論

從20世紀(jì)90年代起，PCT作為一種新型的診斷細(xì)菌感染及其繼發(fā)合并癥的鑒別診斷工具，在膿毒癥、膿毒性休克以及嚴(yán)重系統(tǒng)炎癥反應(yīng)等細(xì)菌感染類(lèi)疾病診斷和療效觀察方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，且特異性高[4]。2001年國(guó)際膿毒癥會(huì)議的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)已把PCT作為診斷指標(biāo)之一[5]。近年來(lái)PCT被認(rèn)為是系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征、膿毒癥、急性呼吸窘迫綜合征等疾病的預(yù)警指標(biāo)[6]。與C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素6等傳統(tǒng)細(xì)菌感染標(biāo)志物相比，PCT的優(yōu)勢(shì)是明顯的，特別是在區(qū)分細(xì)菌感染和非細(xì)菌感染方面[7]。在目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上，生產(chǎn)PCT的廠家很多，采用的方法學(xué)也各不相同，測(cè)定的敏感性和特異性不同，使PCT真正的臨床價(jià)值不能得到發(fā)揮。法國(guó)生物梅里埃VIDAS自動(dòng)急癥檢測(cè)系統(tǒng)用ELISA熒光標(biāo)記測(cè)定PCT，由于其與參考方法有完全一致的相關(guān)性而占據(jù)了較大的市場(chǎng)份額。因此，敏感、特異、快速、簡(jiǎn)單的PCT方法是臨床期望的。

本研究的創(chuàng)新點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)在于采用了混合單克隆多抗體，增強(qiáng)了檢測(cè)的特異性和敏感性。同時(shí)本體系采用一步法溫育10 min，顯色10 min，在短時(shí)間內(nèi)便能獲得高通量的結(jié)果。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，與法國(guó)生物梅里埃VIDAS PCT試劑盒進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，敏感性為93.2%，特異性為97.9%，兩者檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性。本方法具有良好的依從性，可適于不同規(guī)模醫(yī)療單位應(yīng)用。

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1673-8640(2015)07-0770-02

R446.61

B

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.07.024

2015-01-14)

(本文編輯:姜敏)

翟栓柱，男，1989年生，碩士，主要從事免疫學(xué)研究。