劉 然, 郭春梅, 劉佃香, 李玉梅
(大慶市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,黑龍江大慶1634610)
在防治肺結(jié)核的工作中,由于患者不規(guī)范治療的原因,造成耐藥肺結(jié)核的問(wèn)題非常嚴(yán)重。中國(guó)耐多藥結(jié)核病疫情居高不下,耐藥性結(jié)核病的產(chǎn)生在很大的程度上影響了結(jié)核病治療的療效,尤其耐多藥結(jié)核病(multidrug resistance tuberculosis,MDRTB)已成為當(dāng)前結(jié)核病防治中的一個(gè)難題[1],也是結(jié)核病患者死亡的最大殺手,所以早期能夠及時(shí)、快速地對(duì)結(jié)核病耐藥性進(jìn)行檢測(cè),讓患者得到科學(xué)治療十分重要。目前肺結(jié)核耐藥性主要靠細(xì)菌學(xué)檢查(包括細(xì)菌培養(yǎng)、菌種鑒定與藥物敏感試驗(yàn)),由于結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢,整個(gè)培養(yǎng)、菌種鑒定加上藥物敏感試驗(yàn)時(shí)間最快也要2個(gè)月,不能有效指導(dǎo)臨床治療同時(shí)也加大了病原菌傳播機(jī)會(huì)。由此可見(jiàn),尋找快速的檢測(cè)方法意義重大。我們采用線性探針?lè)ㄓ糜诳焖俸Y查耐多藥肺結(jié)核,只需要2 d時(shí)間[2],就可以檢測(cè)出利福平和異煙肼耐藥的涂片陽(yáng)性肺結(jié)核患者。
1.標(biāo)本來(lái)源 大慶市第二醫(yī)院2014年5月至2014年12月收治的明確診斷為肺結(jié)核住院患者。結(jié)核分枝桿菌涂片陽(yáng)性標(biāo)本86份;結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性30份。
2.主要儀器與試劑 珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的改良L-J培養(yǎng)基及含藥培養(yǎng)基;HAIN結(jié)核分枝桿菌耐藥快速檢測(cè)系統(tǒng)[3];GenoType MTBDRplus試劑盒購(gòu)自德國(guó)Hain公司。
3.傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn) 用傳統(tǒng)改良L-J培養(yǎng)基檢測(cè)對(duì)利福平、異煙肼等抗結(jié)核藥物的敏感性。使用藥物最終濃度分別為利福平40.0μg/mL、異煙肼0.2μg/mL。按照全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程操作要求用接種環(huán)刮取改良L-J培養(yǎng)基表面的菌落,以0.5%Tween 80生理鹽水磨菌配成1 mg/mL的菌液,進(jìn)行100倍稀釋?;靹蚝笕【?.1mL,均勻地接種于培養(yǎng)基斜面上,每1種藥物接種2支培養(yǎng)基,同時(shí)接種0.1mL于不含藥的培養(yǎng)基,每周觀察1次,至4周報(bào)告結(jié)果。
4.線性探針?lè)z測(cè) (1)對(duì)涂片陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè):使用堿處理-中和離心沉淀法對(duì)痰標(biāo)本進(jìn)行前消化處理。0.1mL接種改良L-J培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)。取經(jīng)前消化處理后的痰標(biāo)本按照分子線性探針雜交,嚴(yán)格按照GenoType MTBDR說(shuō)明書要求操作,檢測(cè)流程包括目的基因片段的擴(kuò)增、反向雜交膜顯色(使用GenoTypeHot40專用程序)、結(jié)果判讀;(2)對(duì)陽(yáng)性培養(yǎng)物檢測(cè):將從羅氏培養(yǎng)基上刮取一接種環(huán)結(jié)核分枝桿菌混勻于裝有200μL雙蒸水的1.5 mL離心管中,95℃金屬浴滅活30 min。用基因提取試劑盒提取結(jié)核分枝桿菌核酸,再進(jìn)行基因片段的擴(kuò)增、反向雜交膜顯色(使用GenoTypeHot30專用程序)、結(jié)果判讀。
5.判讀標(biāo)準(zhǔn)(參照試劑盒說(shuō)明書)(1)肉眼觀察雜交條帶顯色情況,只有那些與擴(kuò)增指控帶(AC)強(qiáng)度相同或更強(qiáng)的條帶才可判斷為陽(yáng)性;條帶上的標(biāo)記物質(zhì)控(CC)、AC、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及位點(diǎn)質(zhì)控(rpoB、KatG、inhA)需全部陽(yáng)性,結(jié)果方可進(jìn)行判讀,否則為無(wú)效結(jié)果;(2)野生型探針:所有野生型探針條帶陽(yáng)性,表示檢測(cè)區(qū)沒(méi)有發(fā)生可檢出的突變,試驗(yàn)菌株對(duì)各自抗菌藥物敏感;如果至少有1個(gè)野生型探針信號(hào)缺失,則表示試驗(yàn)菌株對(duì)相應(yīng)的抗菌藥物耐藥;如果rpoB野生型探針信號(hào)缺失,則可得出試驗(yàn)菌株對(duì)利福平耐藥的結(jié)論;如果KatG野生型探針缺失,則可得出試驗(yàn)菌株對(duì)高水平異煙肼耐藥的結(jié)論,如果inhA野生型探針缺失,則可得出試驗(yàn)菌株對(duì)低水平異煙肼耐藥性的結(jié)論;(3)突變探針:如果rpoB突變型探針信號(hào)陽(yáng)性,則可得出試驗(yàn)菌株對(duì)利福平耐藥的結(jié)論;如果KatG突變型探針信號(hào)陽(yáng)性,則可得出試驗(yàn)菌株對(duì)高水平異煙肼耐藥的結(jié)論,如果inhA突變型探針信號(hào)陽(yáng)性,則可得出試驗(yàn)菌株對(duì)低水平異煙肼耐藥性的結(jié)論。
1.對(duì)86份結(jié)核分枝桿菌涂片陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行分析。結(jié)果顯示利福平單耐藥2種方法的符合率為95.6%,見(jiàn)表1。
表1 86份結(jié)核分枝桿菌涂片陽(yáng)性標(biāo)本分析
2.采用傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)和線性探針?lè)ㄍ瑫r(shí)對(duì)30份結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性培養(yǎng)物進(jìn)行分析。結(jié)果顯示利福平單耐藥、異煙肼單耐藥及二者同時(shí)耐藥的符合率均為100%。見(jiàn)表2。
表2 30份結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性培養(yǎng)物分析
3.對(duì)86份結(jié)核分枝桿菌涂片陽(yáng)性標(biāo)本分別采用傳統(tǒng)培養(yǎng)和線性探針?lè)椒z測(cè)分析。發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性84份,陽(yáng)性符合率97.6%,而用線性探針?lè)▌t結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性86份,陽(yáng)性符合率達(dá)100%。
4.對(duì)30份結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性物進(jìn)行線性探針?lè)椒z測(cè),結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群均為陽(yáng)性,符合率為100%(30/30)。
線性探針?lè)ǖ闹饕硎窃跇?biāo)本中提取核酸DNA、用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行多重聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增和反向雜交。通過(guò)檢測(cè)RPOB基因突變(編碼還原型輔酶Ⅰ聚合酶B-亞單位)確定對(duì)利福平的耐藥性[4];通過(guò)檢測(cè)KATG基因(編碼過(guò)氧化氫酶)和INHA基因的啟動(dòng)子區(qū)(編碼NADH烯酰酸性磷酸酶還原酶)確定對(duì)異煙肼的耐藥性[5-6]。
傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)是檢測(cè)藥物耐藥性的金標(biāo)準(zhǔn),但檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)線性探針?lè)?、傳統(tǒng)藥敏法檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥符合性的研究,耐藥結(jié)果符合率達(dá)到了100%。線性探針?lè)焖俸Y查耐多藥肺結(jié)核,只需要2 d時(shí)間。本研究結(jié)果顯示,對(duì)結(jié)核桿菌涂片陽(yáng)性標(biāo)本直接采用線性探針?lè)椒êY查耐多藥肺結(jié)核,既快速又準(zhǔn)確,能快速為臨床提供耐多藥肺結(jié)核的耐藥檢測(cè)結(jié)果,讓患者得到及時(shí)科學(xué)治療,臨床意義重大。
[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.全國(guó)結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報(bào)告(2007-2008)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:1-3.
[2]單萬(wàn)水,單金嵐,詹能勇,等.DNA芯片快速檢測(cè)耐利福平結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2003,26(11):680-682.
[3]中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室.線性探針耐藥性檢測(cè)方法應(yīng)用評(píng)估實(shí)施細(xì)則[S].北京:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心,2010:37-47.
[4]MILLER LP,CRAWFORD JT,SHINNICK TM.The rpoB gene of Mycobacterium tuloercubsis[J].Antimicrob Agents Chemother,1994,38(4):805-811.
[5]MANI C,SELVAKUMAR N,NARAYANAN S,etal.Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from India[J].JClin Microbiol,2001,39(8):2987-2990.
[6]VILCHèZE C,WEISBROD TR,CHEN B,etal.Altered NADH/NAD+ratio mediates coresistance to isoniazid and ethionamide in mycobacteria[J].Antimicrob Agents Chemother,2005,49(2):708-720.