王 娟 李 燕 趙駿達 馬俊旗

新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦科生殖助孕中心婦科門診，新疆烏魯木齊830000

人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白和人端粒酶RNA基因聯(lián)合檢測在宮頸癌篩查中的意義

王 娟 李 燕 趙駿達 馬俊旗▲

新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦科生殖助孕中心婦科門診，新疆烏魯木齊830000

目的探討人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白和人端粒酶RNA基因聯(lián)合檢測在宮頸癌篩查中的意義。方法選取2012年10月～2014年10月新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院行宮頸癌篩查的患者627例，先行液基細胞學檢查，后行陰道鏡檢查并取活檢，同時行人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白檢測和人端粒酶RNA基因檢測。分析不同病癥間臨床指標的變異情況。結(jié)果未見上皮病變或惡性改變（NILM）、意義不明的不典型鱗狀細胞與不典型腺細胞（ASC-US）、不除外高度鱗狀上皮內(nèi)病變的的不典型鱗狀細胞（ASC-H）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）、鱗狀細胞癌（SCC）、腺癌（AC），人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白陽性表達率分別為18.6%、42.9%、51.0%、80.6%、47.4%、5.9%、0.0%，差異有高度統(tǒng)計學意義（χ2=93.770，P＜0.01），呈先升高后降低趨勢，在LSIL達到最高點，在AC降至最低點；人端粒酶RNA基因陽性表達率分別為0.0%、19.9%、36.3%、51.6%、94.7%、100.0%、100.0%，差異有高度統(tǒng)計學意義（χ2=279.564，P＜0.01），呈持續(xù)升高趨勢，在SCC與AC達到最高點。依正常、炎癥、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅰ期、CINⅡ期、CINⅢ期、宮頸癌順序，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白陽性表達率分別為18.6%、46.1%、80.6%、53.3%、25.0%、3.6%，差異有高度統(tǒng)計學意義（χ2=93.015，P＜0.01），呈先升高后降低趨勢，在CINⅠ期達到最高點，在宮頸癌降至最低點；人端粒酶RNA基因陽性表達率分別為0.0%、26.4%、51.6%、93.3%、100.0%、100.0%，差異有高度統(tǒng)計學意義（χ2=269.582，P＜0.01），呈持續(xù)升高趨勢，在CINⅢ期達到最高點。結(jié)論人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白聯(lián)合人端粒酶RNA基因檢測，在宮頸癌前病變中具有較高的指導價值。

人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白；人端粒酶RNA基因；宮頸癌

宮頸癌是臨床常見病癥，也是女性特有疾病之一，在惡性腫瘤疾病中，其發(fā)病率僅次于乳腺癌[1]，每年我國的新發(fā)病例和病死病例約為13.5萬人和5.0萬人[2]，且近年來，其發(fā)病率持續(xù)上升，嚴重影響著婦女的身體健康，也明顯影響患者的預后狀況。因而及早診斷和治療是改善患者的預后，提高患者生活質(zhì)量的有效手段。目前，臨床篩查宮頸癌的臨床指標有多種，其中人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白是評價人乳頭狀瘤病毒感染狀態(tài)的有效指標[3-4]。在宮頸細胞由非典型性病變向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)變過程中，幾乎都伴有3號染色體長臂擴增，且常見片段位于3q26～27，且定位于3q26.3的人端粒酶基因中，因而檢測人端粒酶RNA基因有助于篩查宮頸癌[5-6]。為探討人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白和人端粒酶RNA基因聯(lián)合檢測在宮頸癌篩查中的意義，本研究選取新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）行宮頸癌篩查的患者627例，先行液基細胞學檢查，后行陰道鏡檢查并取活檢。同時行人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白檢測和人端粒酶RNA基因檢測?，F(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年10月～2014年10月于我院行宮頸癌篩查的女性患者627例，排除患有其他器質(zhì)性疾病、血液性疾病、免疫性疾病、精神疾病的患者。宮頸癌的診斷標準符合2011年《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準（WS 334-2011）》，后經(jīng)病理組織學檢查確診。年齡21～63歲，平均（35.6±10.7）歲；體重37～74 kg，平均（43.8±11.5）kg；其中未婚婦女134例，已婚婦女493例；未妊娠婦女102例，妊娠婦女391例；妊娠婦女中，初產(chǎn)婦276例，經(jīng)產(chǎn)婦115例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者和/或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

所有患者先行液基細胞學檢查，后行陰道鏡檢查并取活檢。

1.2.1 液基細胞學檢查用特制的長柄毛刷在宮頸鱗柱交界的部位行順時針旋轉(zhuǎn)5圈，然后將刷頭置入配套保存瓶（內(nèi)含固定液）中，使用超柏氏薄層細胞檢測系統(tǒng)對標本實施批量預處理，制片并染色，使用美國Cytye公司生產(chǎn)的Thinprep 2000液基模式薄層掃描儀進行細胞學檢測。

1.2.2 陰道鏡檢查并取活檢所用儀器為美國威龍公司生產(chǎn)的8900型偉花電子陰道鏡，在非月經(jīng)期窺器暴露宮頸，將宮頸表面分泌物拭凈，用浸透3%～5%冰乙酸的棉球浸潤宮頸30～60 s，在鏡下觀察轉(zhuǎn)化去的改變情況，包括顏色、血管、形態(tài)，同時觀察鱗狀上皮和柱狀上皮交界處，尋找異常陰道鏡圖像，在可疑部位取組織行活檢，這些部位包括白色上皮、點狀血管、鑲嵌、腺口周圍白環(huán)、異性血管、明顯突起的部位，未見可疑病變時，可在轉(zhuǎn)化區(qū)3、6、9、12點和宮頸管做活檢，將活檢組織放入10%福爾馬林液中固定，行石蠟包埋、切片、HE染色，由專業(yè)的閱片人員進行檢測。

1.2.3 人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白檢測人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白檢測試劑盒購自于美國Advanced醫(yī)療科技有限公司，采用DNA核酸雜交與免疫組織雙重檢測，包括6、11、16、18、31、45型等在內(nèi)的28型人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白，嚴格按照說明書進行操作。人端粒酶RNA基因聯(lián)合檢測試劑盒購自于北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司，采集20例正常人的宮頸細胞，使用低滲紙片法制備玻片，然后建立試驗閾值，嚴格按照說明書進行操作，實施細胞滴片制備、預處理、變性、雜交、閱片。未見上皮病變或惡性改變（NILM）、意義不明的不典型鱗狀細胞與不典型腺細胞（ASCUS）、不除外高度鱗狀上皮內(nèi)病變的的不典型鱗狀細胞（ASC-H）、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅰ期的結(jié)果判定：細胞基因擴增檢測值高于閾值為陽性，可認定為存在hTERC基因異常擴增，而檢測值低于閾值可認定為陰性。

1.3 評定標準

1.3.1 人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白的評定標準[7]人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白定位于病變細胞的細胞核內(nèi)時，會出現(xiàn)紅棕色，可定性為陽性，否則為陰性。

1.3.2 人端粒酶RNA基因的評定標準[8]對20例正常人員行細胞涂片，每例計數(shù)100個，記錄基因異常擴增細胞數(shù)目的百分比，異常閾值=平均數(shù)+3×標準差，結(jié)果為6.4%，高于6.4%為人端粒酶RNA基因異常擴增陽性，否則為陰性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 液基細胞學檢查結(jié)果中不同病癥間臨床指標的變異情況比較

依NILM、ASC-US、ASC-H、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）、鱗狀細胞癌（SCC）、腺癌（AC）順序，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白陽性表達率呈先升高后降低趨勢，在LSIL達到最高點（80.6%），在AC降至最低點（0.0%）。人端粒酶RNA基因陽性表達率出持續(xù)升高趨勢，在SCC與AC升至最高點（100.0%）。見表1。

表1 液基細胞學檢查結(jié)果中不同病癥間臨床指標的變異情況比較[n（%）]

2.2 液基細胞學檢查結(jié)果中不同病癥間臨床指標的變異情況比較

正常、炎癥、CINⅠ期、CINⅡ期、CINⅢ期、宮頸癌順序，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白陽性表達率呈先升高后降低趨勢，在CINⅠ期達到最高點（80.6%），在宮頸癌降至最低點（3.6%）。人端粒酶RNA基因陽性表達率呈持續(xù)升高趨勢，在CINⅢ期升至最高點（100.0%）。見表2。

表2 液基細胞學檢查結(jié)果中不同病癥間臨床指標的變異情況比較[n（%）]

3 討論

宮頸癌也稱子宮頸癌，指發(fā)生在子宮陰道部及宮頸管的惡性腫瘤，是女性常見惡性腫瘤之一，不但在女性生殖器官癌瘤中占首位，而且在女性各種惡性腫瘤中也是較為多見的[9-10]。發(fā)病原因目前尚不清楚，早婚、早育、多產(chǎn)及性生活紊亂的婦女有較高的患病率。宮頸癌與多種因素有關，其中關鍵因素之一就是高危型人乳頭狀瘤病毒的持續(xù)感染。

人乳頭狀瘤病毒存在多種亞型，可誘發(fā)不同組織學分型的宮頸病變，其中低危型人乳頭狀瘤病毒感染可造成良性皮膚表現(xiàn)或外生殖器疾病良性表現(xiàn)，例如疣。高危型人乳頭狀瘤病毒感染往往會造成癌的發(fā)生，很多宮頸癌患者可檢測到人乳頭狀瘤病毒16亞型或18亞型，因而認為持續(xù)感染的高危型人乳頭狀瘤病毒致癌基因表達是宮頸癌發(fā)生的重要因素之一[11-12]。但并非所有的人乳頭狀瘤病毒感染患者會發(fā)生宮頸癌。

在不同種屬的人乳頭狀瘤病毒中，其主要的衣殼蛋白為人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白，占人乳頭狀瘤病毒表面蛋白的90%以上，這對于完整病毒顆粒的合成是具有決定性作用的，也是病毒感染細胞的主要靶位，還是機體免疫反應攻擊人乳頭狀瘤病毒的主要靶位。當病毒處于增值狀態(tài)時，病因基因未整合到宿主細胞上，細胞可正常分化，L1殼蛋白表達正常，能激發(fā)機體細胞免疫系統(tǒng)對感染細胞的識別和清除。因而在疾病發(fā)展的前期，隨著病癥的惡化，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白陽性率會明顯增加。

當病因基因整合到宿主細胞上，病毒處于整合狀態(tài)，細胞分化受到阻礙，L1殼蛋白無法正常表達。而L1殼蛋白缺失會讓宮頸免疫效應減弱，同時失去了攻擊人乳頭狀瘤病毒的靶位，機體將無法識別并清除變異細胞，使得異常增值細胞得以生存，造成了疾病的進一步惡化。此時宮頸上皮內(nèi)瘤變細胞逃脫了細胞免疫系統(tǒng)的監(jiān)測和清除功能，可持續(xù)存在并進展為癌，而此時L1殼蛋白無法合成，將顯著降低。因而認為人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白在病因基因整合到宿主細胞以后，會出現(xiàn)顯著降低的趨勢，直到發(fā)展為癌。

端粒酶是目前較為常見的惡性腫瘤分子標志物，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。人端粒酶RNA基因是疾病進展的潛在分子標志物[13-14]，其擴增可能與高級別宮頸病變有關。端粒酶是一種核糖核蛋白復合體，是由RNA與蛋白質(zhì)組成的依賴RNA的DNA聚合酶，這是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，它能以自身攜帶的RNA為模板，然后逆轉(zhuǎn)錄合成DNA，再加至染色體末端，從而維持端粒長度的穩(wěn)定性。正常情況下，體細胞和組織端粒酶是陰性的，當其發(fā)生激活時，端粒酶可以自身RNA為模板合成端粒DNA，已補充細胞分裂時端粒的縮短，因而，當細胞發(fā)生無限增殖時，細胞會出現(xiàn)永生化，最終誘發(fā)癌。端粒酶活化是宮頸癌發(fā)生的必經(jīng)之路，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，需要端粒酶的參與，病癥越嚴重，人端粒酶RNA基因的陽性表達率越高。

此研究結(jié)果表明，按NILM、ASC-US、ASC-H、LSIL、HSIL、SCC、AC順序，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白陽性表達率呈現(xiàn)出先升高后降低趨勢，在LSIL達到最高點（80.6%），在AC降至最低點（0.0%）。人端粒酶RNA基因陽性表達率呈持續(xù)升高趨勢，在SCC與AC升至最高點（100.0%）。依正常、炎癥、CINⅠ期、CINⅡ期、CINⅢ期、宮頸癌順序，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白陽性表達率呈先升高后降低趨勢，在CINⅠ期達到最高點（80.6%），在宮頸癌降至最低點（3.6%）。人端粒酶RNA基因陽性表達率出持續(xù)升高趨勢，在CINⅢ期升至最高點（100.0%）。說明無論是液基細胞學檢查，還是陰道鏡活檢，都顯示宮頸癌發(fā)展的不同階段，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白和人端粒酶RNA基因會發(fā)生不同程度的改變，兩種結(jié)合檢測可對疾病進行準確定性。這與諸多研究的結(jié)果是相似的，陸萍等[15]研究結(jié)果顯示，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的陽性表達隨病變程度的加重而呈下降趨勢，提示其有望成為預測宮頸癌前病變程度的標志物，對于宮頸癌前病變的篩查和預防具有重要的意義。林志新等[16]研究結(jié)果顯示，hTERC基因FISH檢測與HR-HPVHCⅡ檢測比較能更可靠地辨別宮頸病變的程度，檢測hTERC基因擴增對判斷早期宮頸病變進展風險可能有一定的預測意義，有望作為宮頸癌早期篩查、病情判斷和評估預后的輔助指標之一。

綜上所述，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白聯(lián)合人端粒酶RNA基因檢測，在宮頸癌前病變中具有較高的指導價值。此次研究也存在一定弊端，樣本量較少，需要進一步擴大，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白和人端粒酶RNA基因聯(lián)合檢測能否對所有宮頸疾病進行準確定位和定性，尚需進一步研究。

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Significance of human papilloma virus L1 protein and human telomerase RNA gene combined detection in cervical cancer screening

WANG JuanLI YanZHAO JundaMA Junqi▲
Gynecological Clinic,Gynecological Assisted Reproductive Center,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi830000,China

Objective To investigate significance of human papilloma virus L1 protein and human telomerase RNA gene combined detection in cervical cancer screening.Methods From October 2012 to October 2014,in the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,627 patients given cervical cancer screening were selected.Firstly,the patients received liquid based cytology,then they received colposcopy and biopsy,at the same time,they also received human papilloma virus L1 protein detection and human telomerase RNA gene detection.The variation of clinical indicators were analyzed between different conditions.Results According to sequence of NILM,ASC-US,ASC-H,LSIL, HSIL,SCC,AC,positive expression ratio of human papilloma virus L1 protein were 18.6%,42.9%,51.0%,80.6%, 47.4%,5.9%,0.0%,the difference was statistically significant(χ2=93.770,P＜0.01),which showed increasing at first and then decreasing,it reached highest point at LSIL,and reached lowest point at AC;positive expression ratio of human telomerase RNA gene were 0.0%,19.9%,36.3%,51.6%,94.7%,100.0%,100.0%,the difference was statistically significant(χ2=279.564,P＜0.01),which showed continue increasing,it reached highest point at SCC and AC.According to sequence of normal,inflammation,CIN phaseⅠ,CIN phaseⅡ,CIN phaseⅢ,cervical cancer,positive expression ratio of human papilloma virus L1 protein were 18.6%,46.1%,80.6%,53.3%,25.0%,3.6%,the difference was statistically significant(χ2=93.015,P＜0.01),which showed increasing at first and then decreasing,it reached highest point at CIN phaseⅠ,and itreached lowest point at cervical cancer;positive expression ratio of human telomerase RNA gene were 0.0%,26.4%,51.6%,93.3%,100.0%,100.0%,the difference was statistically significant (χ2=269.582,P＜0.01),which showed continue increasing,it reached highest point at CIN phaseⅡ.Conclusion Human papilloma virus L1 protein and human telomerase RNA gene combined detection has higher guiding value in cervical precancerous lesions.

Human papilloma virus L1 protein;Human telomerase RNA gene;Cervical cancer

R737.33

A

1673-7210（2015）06（b）-0060-04

2015-02-10本文編輯：蘇暢）

王娟（1982.11-），女，碩士研究生；研究方向：宮頸病變的診療。

▲通訊作者