梁婷婷 裴強(qiáng) 王洪波 范玉磊 魏中秋 馮莉 孫影▲.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)：病理學(xué)系，河北唐山06000；.河北聯(lián)合大學(xué)附屬遵化市人民醫(yī)：心內(nèi)科，河北唐山06400；.河北聯(lián)合大學(xué)附屬遵化市人民醫(yī)：外科，河北唐山06400

硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶3在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥大中的表達(dá)

梁婷婷1裴強(qiáng)2王洪波3范玉磊1魏中秋1馮莉1孫影1▲
1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)：病理學(xué)系，河北唐山063000；2.河北聯(lián)合大學(xué)附屬遵化市人民醫(yī)：心內(nèi)科，河北唐山064200；3.河北聯(lián)合大學(xué)附屬遵化市人民醫(yī)：外科，河北唐山064200

目的觀察硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶3（Prdx-3）在血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的表達(dá)。方法體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞（H9C2）隨機(jī)分為對照組和AngⅡ組（AngⅡ1×10-6mol/L處理）。Real time PCR法檢測腦鈉素（BNP）mRNA表達(dá)，二氯熒光素二乙酸（DCFH-DA）檢測活性氧（ROS）水平，Western blot法檢測Prdx-3蛋白表達(dá)。結(jié)果①與對照組比較，AngⅡ刺激6、12、24、48 h的BNP mRNA分別增長（1.10±0.08）、（1.30±0.18）、（1.80± 0.25）、（2.00±0.37）倍，除刺激6 h外，其他時(shí)間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。②AngⅡ刺激5、10、20、40 min和1 h ROS水平分別是（3740±75）、（3911±91）、（4330±143）、（4073±335），（3879±226），與對照組（3426±197）比較，刺激5、10、20 min時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。③AngⅡ刺激30 min、1 h、3 h和6 h時(shí)Prx-3蛋白的表達(dá)值分別為（0.72±0.11）、（0.50±0.07）、（0.42±0.08）和（0.35±0.08），與對照組（0.33±0.05）比較，AngⅡ刺激30 min和1 h時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論在AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大過程中伴隨著Prdx-3表達(dá)的上調(diào)，推測Prdx-3表達(dá)與降低ROS有關(guān)。

硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶3；活性氧；心肌肥大；血管緊張素Ⅱ

高血壓是以動脈血壓持續(xù)性增高為主要特征的一種常見慢性疾病，晚期累及心臟，造成高血壓性心臟病。高血壓性心臟病主要病理表現(xiàn)是心肌肥大，但持續(xù)性心肌肥大會導(dǎo)致心力衰竭，最終引起患者死亡。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是誘導(dǎo)高血壓的重要物質(zhì)之一，可在高血壓心臟微環(huán)境中表達(dá)增高，作用于心肌細(xì)胞，造成心肌細(xì)胞肥大［1］。硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶3（peroxiredoxin-3，Prdx-3）是一種新型過氧化物酶，存在于線粒體，與硫氧還蛋白2（Trx-2）一起清除來自于線粒體的活性氧（ROS）［2］。研究顯示Prdx-3在多種病理過程中均表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮機(jī)體保護(hù)作用［3］。ROS在肥大的心肌中表達(dá)升高，但同時(shí)是否Prdx-3可被反應(yīng)性地激活，目前報(bào)道較少。本研究利用體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，觀察Prdx-3在AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大中的表達(dá)，為深入探究Prdx-3在心肌肥大中的作用及成為高血壓心臟病靶向治療新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

H9C2大鼠心肌細(xì)胞（中國科學(xué)：上海生命科學(xué)研究：提供）；血管緊張素Ⅱ（Sigma公司）；腦鈉素上下游引物（上海吉瑪公司）；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR+Tap混合劑（美國invitrogen公司）；二氯熒光素二乙酸（Sigma公司）；Prdx-3抗體（Abcam產(chǎn)品）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

心肌細(xì)胞在含10%胎牛血清濃度的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞在達(dá)到70%融合后，給予0.4%血清濃度DMEM培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞同步化，然后隨機(jī)分為對照組（僅0.4%血清濃度DMEM）和AngⅡ組（經(jīng)AngⅡ1×10-6mol/L處理）。

1.3 Real time PCR法檢測腦鈉素（BNP）mRNA表達(dá)[4]

細(xì)胞未經(jīng)或經(jīng)AngⅡ刺激6、12、24、48 h，棄培養(yǎng)液，利用Trizol提取細(xì)胞總RNA,定量后取0.5 μg RNA行逆轉(zhuǎn)錄。取1 μL cDNA進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：SYRB+Taq混合劑10 μL，Prx-1或GAPDH上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，雙蒸水8 μL；擴(kuò)增條件：95℃變性30 s后，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。BNP上游引物序列5'TGGGCAGAAGATAGACCGGA 3'，下游5'ACAACCTCAGCCCGTCACAG 3'；GAPDH上游引物5'GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG3'，下游引物5'ATGGTGGTGAAGACGCCAGTAA 3'。GAPDH為內(nèi)參照，各組BNP mRNA表達(dá)量以各樣本與對照組的倍數(shù)表示。

1.4 二氯熒光素二乙酸（DCFH-DA）檢測ROS水平

DCFH-DA沒有熒光，能自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解生成還原型二氯熒光素（DCFH），DCFH不能通過細(xì)胞膜，但可被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化生成氧化型二氯熒光素（DCF），DCF可發(fā)出熒光。因此DCF的熒光量可以反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。本實(shí)驗(yàn)中，AngⅡ刺激心肌細(xì)胞0、5、10、20、40 min和1 h，0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，加入DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L，37℃孵育20 min后，PBS洗3次，去掉未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，計(jì)數(shù)10 000個細(xì)胞，熒光酶標(biāo)儀測定激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm處的熒光強(qiáng)度。

1.5 Western blot法檢測Prdx-3蛋白表達(dá)

細(xì)胞經(jīng)或未經(jīng)AngⅡ刺激30 min、1 h、3 h和6 h，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗，細(xì)胞裂解液冰上震蕩裂解30 min，收集裂解細(xì)胞，低溫高速離心15 min，收集上清，-70℃保存。以考馬斯亮藍(lán)R-250染色測定蛋白濃度，每孔50 μg上樣并電泳、轉(zhuǎn)膜。5%牛血清白蛋白封閉1 h，Prdx-3抗體（1∶1000稀釋），4℃孵育過夜。二抗（1∶3000稀釋），室溫孵育2h。BCIP/NBT（1∶50稀釋）顯色3 min。Image J軟件對蛋白表達(dá)條帶進(jìn)行灰度定量分析，以Prdx-3與GAPDH灰度比值作為Prdx-3表達(dá)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；重復(fù)測量的計(jì)量資料比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BNP mRNA表達(dá)

與對照組比較，AngⅡ刺激6、12、24、48 h的BNP mRNA分別增長（1.10±0.08）、（1.30±0.18）、（1.80± 0.25）、（2.00±0.37）倍，除AngⅡ刺激6 h外，其他刺激時(shí)間點(diǎn)的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 ROS水平

對照組的ROS水平為（3426±197），AngⅡ刺激5、10、20、40 min和1 h ROS水平分別是（3740±75）、（3911± 91）、（4330±143）、（4073±335），（3879±226）。與對照組比較，AngⅡ刺激5、10、20 min時(shí)ROS水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 Prdx-3蛋白表達(dá)

對照組Prdx-3蛋白的表達(dá)值為（0.33±0.05），AngⅡ刺激30 min、1 h、3 h和6 h時(shí)Prdx-3蛋白的表達(dá)值是（0.72±0.11）、（0.50±0.07）、（0.42±0.08）和（0.35± 0.08）。與對照組比較，AngⅡ刺激30 min和1 h時(shí)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Western blot法檢測細(xì)胞Prdx-3蛋白表達(dá)情況

3 討論

BNP雖然首先是從豬腦中分離出來的，但其合成主要在心室肌細(xì)胞，并分泌入血［5］。研究顯示BNP在高血壓心肌肥大中表達(dá)增高，是心肌肥大標(biāo)志性活性多肽分子［6-9］。

ROS包括氧自由基、過氧化物和激發(fā)態(tài)氧等，具有很高的化學(xué)活性。正常時(shí)體內(nèi)ROS的濃度很低，對機(jī)體具有保護(hù)作用，但過多的ROS可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、DNA鏈斷裂、蛋白質(zhì)修飾變性，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死［10］。筆者前期研究顯示自于線粒體的ROS介導(dǎo)了高血壓誘導(dǎo)心肌肥大和心功能下降［11］。最近報(bào)道也證實(shí)心臟微環(huán)境內(nèi)的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)通過誘導(dǎo)ATP依賴的鉀離子通道開放促進(jìn)線粒體產(chǎn)生更多ROS，并由此引起Ⅰ型鈉氫交換體和碳酸氫鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的激活，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大［1］。而Prdx-3是一種新型的過氧化物酶，是該家族成員中唯一特異性定位于線粒體的酶蛋白。Prdx-3、Trx2及硫氧還蛋白還原酶2（TrxR2）一起構(gòu)成Prdx-3-Trx-TrxR氧化還原體系，催化來自線粒體的過氧化氫（H2O2）轉(zhuǎn)變成H2O，從而調(diào)控線粒體內(nèi)H2O2濃度水平，保護(hù)細(xì)胞存活、生長和增殖［12］。如有研究顯示，來源于線粒體的ROS促進(jìn)了惡性間皮瘤細(xì)胞合成Prdx-3蛋白，以降低細(xì)胞內(nèi)過高的H2O2濃度，使細(xì)胞更易于生長和增殖［11］。另外，Prdx-3高表達(dá)能夠減輕毒物誘導(dǎo)的大鼠海馬區(qū)神經(jīng)的損傷和保護(hù)肝癌細(xì)胞免于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［13-15］。

本研究利用AngⅡ作用于心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在AngⅡ刺激12 h時(shí)，BNP mRNA的表達(dá)開始增高，隨后隨著刺激時(shí)間延長，表達(dá)逐漸增高，具有時(shí)效性，說明AngⅡ上調(diào)BNP基因的表達(dá)，刺激了心肌細(xì)胞肥大。另外，AngⅡ作用5 min時(shí)心肌細(xì)胞ROS的水平即開始增高，20 min時(shí)達(dá)到高峰，說明AngⅡ可刺激心肌細(xì)胞快速產(chǎn)生ROS；同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)AngⅡ刺激心肌細(xì)胞30 min時(shí)，Prdx-3蛋白表達(dá)明顯高于對照組，隨后表達(dá)有所下降，提示AngⅡ還能快速上調(diào)心肌細(xì)胞Prdx-3表達(dá)。推測Prdx-3蛋白在心肌細(xì)胞的快速上調(diào)可能與降低AngⅡ誘導(dǎo)的ROS有關(guān)，但其后期表達(dá)不足可能會促進(jìn)心臟的氧化應(yīng)激，因此提高Prdx-3的表達(dá)可能成為抑制高血壓心肌肥大的新途徑之一。

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Expression of peroxiredoxin-3 in angiotensinⅡinducing cardiomyocytes hypertrophy

LIANG Tingting1PEI Qiang2WANG Hongbo3FANG Yulei1WEI Zhongqiu1FENG Li1SUN Ying1▲
1.Department of Pathology Primary Medicine College,Hebei United University,Hebei Province,Tangshan063000, China;2.Department of Cardiology,Zunhua People's Hospital Affiliated to Hebei United University,Hebei Province,Tangshan064200,China;3.Department of Surgery,Zunhua People's Hospital Affiliated to Hebei United University,Hebei Province,Tangshan064200,China

ObjectiveTo observe the expression of peroxiredoxin-3(Prdx-3)in AngiotensinⅡ(AngⅡ)inducing cardiomyocytes hypertrophy.MethodsCultured cardiomyocytes were randomly divided into control group and AngⅡgroups(dealed with AngⅡ1×10-6mol/L).BNP mRNA and reactive oxygen species(ROS)were measured by Realtime PCR and DCFH-DA;while Prdx-3 expression was by Western blot.Results①Compared with control group,BNP mRNA expression increased(1.10±0.08),(1.30±0.18),(1.80±0.25),(2.00±0.37)times respectively when AngⅡstimulated at 6,12,24,48 h,except at 6 h,the differences were statistically significant(P＜0.05).②The level of ROS in control group was(3426±197),ROS increased to(3740±75),(3911±91),(4330±143),(4073±335),(3879±226)respectively when AngⅡstimulated at 5,10,20,40 min and 1 h,compared with control group,the differences were statistically significant(P＜0.05).③The level of Prdx-3 in control group was(0.33±0.05),Prdx-3 increased to(0.72±0.11), (0.50±0.07),(0.42±0.08),(0.35±0.08)when AngⅡstimulated at 30 min,1 h,3 h and 6 h,compared with control group, the differences of AngⅡstimulated at 30 min,1 h were statistically significant(P＜0.05).ConclusionCardiomyocytes hypertrophy is associated with Prdx-3 upregulation induced by AngiontensinⅡ.

Peroxiredoxin-3;Reactive oxygen species;Cardiomyocytes hypertrophy;AngiotensinⅡ

R541.6

A

1673-7210（2015）07（a）-0027-03

2015-02-02本文編輯：蘇暢）

河北省留學(xué)人員科技活動項(xiàng)目（D2012003028）?！?/p>