李上海 梁偉鈞 王苗廣東醫(yī)學(xué)：附屬醫(yī)：心內(nèi)科，廣東湛江524000

辛伐他汀對缺血再灌注損傷下內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的影響

李上海 梁偉鈞▲王苗
廣東醫(yī)學(xué)：附屬醫(yī)：心內(nèi)科，廣東湛江524000

目的觀察辛伐他汀對缺血再灌注損傷下內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）凋亡的影響。方法將EPCs隨機分為對照組（C組）、缺血再灌注組（IR組）、辛伐他汀組（S組），MTT法測定各組EPCs增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)測定各組EPCs凋亡率。結(jié)果與C組比較，IR組EPCs抑制率上升［（18.00±0.00）%比（3.60±0.33）%］，細(xì)胞凋亡率上升［（9.55±0.79）%比（4.68±0.33）%］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01、P＜0.05）；而S組EPCs增殖率上升［（53.00±0.00）%比（13.38± 1.80）%］，凋亡率下降［（2.42±0.37）%比（4.68±0.33）%］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論辛伐他汀通過促進EPCs增殖能力、減少EPCs凋亡來發(fā)揮其對缺血再灌注損傷下EPCs的保護作用。

辛伐他汀曰缺血再灌注損傷曰內(nèi)皮祖細(xì)胞曰細(xì)胞凋亡

近年來，隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，干細(xì)胞移植技術(shù)越來越受到關(guān)注。有研究認(rèn)為細(xì)胞移植技術(shù)可能成為治愈心肌缺血壞死的有效措施［1］。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，存在于外周血、骨髓和臍帶血中，不僅具有定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞的能力，還可以分泌多種促血管生成因子。EPCs的出現(xiàn)讓很多缺血性心臟病患者看到了希望，但是有研究發(fā)現(xiàn)，EPCs還沒有修復(fù)好壞死心肌就停止了擴增和分化，這一問題值得思考［2］。研究表明，干細(xì)胞生存的微環(huán)境比干細(xì)胞本身更重要［2］。本實驗通過在細(xì)胞水平上建立缺血再灌注模型，并給予辛伐他汀干預(yù)，從細(xì)胞在不同條件下數(shù)量增殖及凋亡方面探討辛伐他汀對缺血再灌注損傷下EPCs的保護作用，試圖為EPCs的移植做初步探討，并為干細(xì)胞的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用4周齡健康SPF級雄性SD大鼠2只（凈重36、38 g），由廣東醫(yī)學(xué)：實驗動物中心提供。實驗動物許可證［SCXK（粵）2008-0002］。

1.2 主要試劑與儀器

倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司），流式細(xì)胞儀（美國BD公司），超凈工作臺（AIRTECH公司），胎牛血清（Hyclone公司），M199培養(yǎng)基（GBICO公司），辛伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品檢驗所），二甲基亞砜（MP公司），0.25%EDTA-胰酶（GBICO公司）等。

1.3 方法

1.3.1 EPCs分離及培養(yǎng)取4周齡SPF級健康雄性SD大鼠2只，頸椎脫臼法處死，置于75%酒精中浸泡10 min。在無菌條件下，用預(yù)冷的生理鹽水肝素鈉混合液沖洗骨髓腔。之后，以2∶1的比例，輕輕將骨髓液置于Ficoll淋巴分離液上層，以2000 r/min速度，離心20 min，離心后離心管內(nèi)可見液體分層。另外2支已滅菌的離心管中，加入同體積已滅菌的PBS緩沖液，小心吸吹混勻后，于離心機內(nèi)以1000 r/min的速度離心5 min，重復(fù)洗滌2次，取出離心管，可以觀察到管底有細(xì)胞沉淀，棄上清液，加入含15%胎牛血清的M199培養(yǎng)基中重懸后加入有膜細(xì)胞瓶中，并置于飽和濕度、37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3 d后首次換液，并開始使用添加VEGF（10 ng/mL）的含15%胎牛血清的M199培養(yǎng)液，以后隔1 d換液1次。1.3.2缺血再灌注模型的建立及實驗分組本研究采用連二亞硫酸鈉（Sodium hydrosulfite，Na2S2O4）制備的缺血再灌注模型是在余薇等［3］的研究基礎(chǔ)上稍加改造而成。消化并重懸生長良好的EPCs于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，將EPCs隨機分成3組，每組設(shè)立5個復(fù)孔。待細(xì)胞生長穩(wěn)定后模型組更換缺血緩沖液，該緩沖液被設(shè)計來模擬心肌缺血時細(xì)胞外環(huán)境的變化，如活體內(nèi)相似的鉀、鈉離子等。缺血3 h后更換選擇性培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)21 h后進行各項檢測。將EPCs隨機分為三組：對照組（C組）：選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d；缺血再灌注組（IR組）：第1天用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，第2天加入缺血緩沖液，刺激細(xì)胞3 h后，換成選擇性培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)21 h；辛伐他汀組（S組）：第1天選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，第2天添加最佳濃度阿托伐他汀后繼續(xù)培養(yǎng)1 d。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 MTT法檢測各組EPCs的增殖率用含0.25% EDTA的胰酶消化一瓶生長良好的EPCs，按照3×104/mL密度重懸后加入到96孔板中，每孔體積為100 μL。待EPCs生長穩(wěn)定后，按“1.3.2”中的方法分組（每組5個復(fù)孔）及處理后，棄去上清液，PBS緩沖液輕輕洗滌2次，之后每孔加入MTT工作液（5 mg/mL）各10 μL及選擇性培養(yǎng)基各90 μL，4 h后再次棄去上清液，每孔添加二甲基亞砜（DMSO）各100 μL，在微量振蕩器上避光振蕩10 min使其充分溶解，于酶標(biāo)儀492 nm處測每孔OD值。檢測各組EPCs的增殖率。

1.4.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組EPCs的凋亡情況用含0.25%EDTA的胰酶消化3瓶生長良好的EPCs，按4×106/mL的密度重懸后加入到6孔板中，每孔體積為1 mL。待EPCs生長穩(wěn)定后，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組EPCs的凋亡率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗數(shù)據(jù)均應(yīng)用SAS 8.0進行處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較兩兩比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPCs鏡下形態(tài)結(jié)果

倒置顯微鏡下觀察剛分離出來的單個核細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中，呈圓形（圖1a）。3 d時細(xì)胞已基本貼壁，細(xì)胞體積開始變大，部分呈現(xiàn)梭形（圖1b）。隨著細(xì)胞的生長，細(xì)胞體積逐漸變大，數(shù)量逐漸增多，7 d時細(xì)胞呈集落樣生長（圖1c、d），大多數(shù)呈梭形，少數(shù)呈多角形，部分貼壁細(xì)胞仍呈圓形，分布不均勻。14 d可見一部分細(xì)胞頭尾相接，呈線索樣或毛細(xì)血管網(wǎng)樣（圖1e），或呈典型的“鋪路石”形態(tài)（圖1f）。2.2 MTT法檢測辛伐他汀干預(yù)后缺血再灌注下EPCs的生長情況

圖1 顯微鏡下內(nèi)皮祖細(xì)胞不同時段的形態(tài)

與C組比較，IR組EPCs抑制率明顯上升（P＜0.01），S組增殖率明顯上升（P＜0.05），提示IR組的EPCs在Na2S2O4的作用下，細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞數(shù)量較C組減少。而與C組比較，S組EPCs生長迅速，細(xì)胞數(shù)量增加。見表1。

表1 各組EPCs的生長情況比較（x±s，n=3）

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組EPCs的凋亡率

各組EPCs凋亡率比較，S組最低［（2.42±0.37）%］，IR組最高［（9.55±0.79）%］，與C組［（4.68±0.33）%］比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，EPCs具有分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的能力。在外傷、缺血、炎癥因子等作用下，EPCs從骨髓中遷移至外周血中，隨著血液循環(huán)到達損傷部位，形成毛細(xì)血管和分泌血管生成因子促血管新生。研究發(fā)現(xiàn)EPCs還可分化為心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞［4］。這提示，在心肌梗死發(fā)生以后移植EPCs，可促血管生成及心肌恢復(fù)，從而改善心臟功能。然而在成人外周血及骨髓中，EPCs數(shù)量都很少，對于移植來說，數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，這使得我們不得不想辦法來解決EPCs的數(shù)量問題。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)，微環(huán)境對于移植后干細(xì)胞生存能力比干細(xì)胞本身更重要［2］。微環(huán)境的改變對干細(xì)胞命運的影響是有利還是不利，以及影響程度如何還有待于進一步研究。然而，也有學(xué)者認(rèn)為干細(xì)胞處于缺血再灌注的環(huán)境中會加速其凋亡，對干細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響［5］。因此，解決體內(nèi)干細(xì)胞數(shù)量少不能滿足移植需要以及如何為干細(xì)胞提供一個適合干細(xì)胞生存并發(fā)揮作用的微環(huán)境是本研究的意義所在。

目前認(rèn)為，長期膽固醇升高可損傷血管內(nèi)皮功能，引起動脈粥樣硬化、冠心病及高血壓等心血管疾病。他汀類藥物通過抑制膽固醇的合成和上調(diào)肝臟內(nèi)低密度脂蛋白的表達，從而降低血漿中膽固醇水平。此外，其多效性，如：改善內(nèi)皮功能、抗血小板、抗感染、抗纖維化、抗氧化應(yīng)激等，在心血管疾病中也發(fā)揮了重大作用。研究表明，他汀類藥物對缺血再灌注心肌具有保護作用［5］。Vilahur等［6］發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀能明顯減少冠狀動脈和心臟氧化DNA損傷，減少中性粒細(xì)胞在缺血心肌的浸潤，保護線粒體膜電位和減少細(xì)胞凋亡，從而保護心肌梗死后的心肌纖維化。Xia等［7］發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀和心肌缺血后處理有相似的心血管效應(yīng)，抑制ER應(yīng)激相關(guān)的凋亡途徑減輕心肌缺血再灌注損傷，明顯降低心肌損傷標(biāo)志物的血清濃度，減少梗死面積，并改善左心室收縮功能。Kisv佗ri等［8］在進行缺血再灌注前，用辛伐他汀預(yù)處理，最后發(fā)現(xiàn)辛伐他汀與對照組比較，顯著降低室早的次數(shù)［（289±34）次比（94±25）次］、室速發(fā)作次數(shù)［（5.6±1.3）次比（0.3± 0.2）次］，增加了心肌再灌注損傷的生存率（0%比33%）。Tian等［9］在實驗中用阿托伐他汀證明在心肌缺血再灌注中通過激活由骨髓來源的細(xì)胞活化的eNOS來減少小鼠中的心肌梗死面積。Oikonomou等［10］收集了大量動物和人體實驗結(jié)果，總結(jié)為他汀類藥物通過降低血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、增強eNOS活性或者以上幾種機制共同作用來增強缺血性心肌病心力衰竭患者EPCs從骨髓向外周血遷移，從而改善缺血性心臟衰竭患者的血管內(nèi)皮功能。但是Zhang等［11］研究發(fā)現(xiàn)，EPCs表達內(nèi)皮細(xì)胞中血管源性的微小RNA，同時阿托伐他汀可影響EPCs中微小RNA，因此認(rèn)為，他汀類可能通過調(diào)節(jié)血管源性的微小RNA來影響冠心病患者體內(nèi)EPCs的功能。這可能又是他汀保護EPCs的另一個機制。然而，他汀又是通過什么機制來抑制EPCs的凋亡呢?Mamoru等［12］發(fā)現(xiàn)，冠心病患者體內(nèi)EPCs的端粒長度較健康人的短，給予他汀類藥物強化降脂治療后，冠心病患者體內(nèi)的EPCs數(shù)量增加，而且EPCs中的端粒不縮短。由此可見，他汀類藥物可能是通過阻止EPCs中端粒的縮短來抗EPCs凋亡的。本研究結(jié)果可見，在辛伐他汀預(yù)處理后，無論是與C組，還是IR組比較，EPCs增殖率、數(shù)量均明顯增加，EPCs的凋亡率降低，這說明了辛伐他汀對缺血再灌注下EPCs具有保護作用。

他汀類藥物可通過降脂、改善內(nèi)皮功能、抗感染、抑制缺血再灌注損傷后氧自由基的暴發(fā)、動員EPCs等機制保護缺血心肌，改善心功能，降低心血管事件的發(fā)生率。簡而言之，詳細(xì)研究他汀類藥物對缺血再灌注損傷的作用及其機制，合理地應(yīng)用他汀類藥物，可以更好地防治缺血再灌注損傷。

然而本實驗仍存在一些不足之處。由于骨髓中含有多種細(xì)胞，從中所獲得的細(xì)胞可能是各種細(xì)胞的混合體，盡管本實驗聯(lián)合采用密度梯度離心法及差速貼壁法，但是細(xì)胞的純度問題仍不容忽視。因此，本實驗

在獲得EPCs后，在進行下一步實驗之前未進行純度鑒定，也是本實驗的缺陷之處。

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Effects of Simvastatin on apoptosis of endothelial progenitor cells against ischemia-reperfusion injury

LI ShanghaiLIANG Weijun▲WANG Miao
Department of Cardiology,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Guangdong Province,Zhanjiang524000, China

ObjectiveTo observe the effects of Simvastatin on apoptosis of endothelial progenitor cells against ischemia-reperfusion injury.MethodsEPCs were randomly divided into control group(group C),ischemia-reperfusion group (group IR),Simvastatin group(group S).The proliferation of EPCs was detected by MTT assay.At the same time,the apoptosis rates of EPCs were detected by flow cytometry.ResultsCompared with group C,the inhibition of EPCs in group IR increased［(18.00±0.00)%vs(3.60±0.33)%］,the apoptotic rate increased clearly［(9.55±0.79)%vs(4.68±0.33)%］, the differences were statistically significant(P＜0.01,P＜0.05);however,the proliferation ratio of EPCs in group S increased［(53.00±0.00)%vs(13.38±1.80)%］,while the apoptotic rate decreased［(2.42±0.37)%vs(4.68±0.33)%］,the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionSimvastatin protects EPCs in the ischemia-reperfusion environment by promoting proliferation capacity and reducing apoptosis rates.

Simvastatin;Ischemia-reperfusion injury;Endothelial progenitor cells;Apoptosis

R965

A

1673-7210（2015）07（a）-0011-04

2015-04-28本文編輯：張瑜杰）

廣東省科技計劃項目（2011B031800325）?！?/p>