張珣 湯穎 李婉 張榮偉中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)：老年神經(jīng)內(nèi)科，遼寧沈陽110001

尼莫地平對小鼠肝部分切除術(shù)后認知功能的影響與機制研究

張珣 湯穎 李婉 張榮偉▲
中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)：老年神經(jīng)內(nèi)科，遼寧沈陽110001

目的探討尼莫地平對小鼠肝部分切除術(shù)后認知功能損傷的保護作用及作用機制。方法將36只18～20月齡健康雄性C57BL/6小鼠隨機分為三組：對照組（C組，n=12），不做任何特殊處理；手術(shù)組（S組，n=12），小鼠在麻醉后行肝部分切除術(shù)；尼莫地平組（Nimo組，n=12），手術(shù)與S組相同，并于術(shù)前1 d開始腹腔注射尼莫地平。每組于術(shù)后3 d處死實驗小鼠，迅速獲取海馬組織。T迷宮實驗檢測實驗小鼠術(shù)后3 d的學(xué)習(xí)和記憶能力；Nissel染色及透射電鏡觀察實驗小鼠海馬神經(jīng)元存活的數(shù)量及超微結(jié)構(gòu)改變；免疫組織化學(xué)方法檢測實驗小鼠海馬Fas和FasL的蛋白表達。結(jié)果與C組比較，S組小鼠認知功能術(shù)后3 d明顯下降（P＜0.05）；與S組比較，Nimo組可改善小鼠術(shù)后3 d的認知功能（P＜0.05）。Nissel染色可見Nimo組術(shù)后3 d小鼠海馬神經(jīng)元存活數(shù)量較S組明顯增多；透射電鏡下可見Nimo組術(shù)后3 d小鼠海馬組織的超微結(jié)構(gòu)改變較S組明顯減輕。Nimo組術(shù)后3 d小鼠海馬組織Fas和FasL表達較S組減少（P＜0.01）。結(jié)論尼莫地平可通過抑制Fas/FasL介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡而改善老齡小鼠的術(shù)后認知功能。

尼莫地平曰肝部分切除術(shù)曰認知功能曰Fas曰FasL

術(shù)后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是老年人的常見術(shù)后并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為認知功能受損，包括學(xué)習(xí)能力和記憶能力的下降、意識和信息處理的障礙等中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，嚴重者可以出現(xiàn)癡呆［1-2］。研究顯示，25%～50%的住：患者在術(shù)后會發(fā)生認知功能的改變［3-4］，同時大約40%的患者在術(shù)后5年仍會有認知受損的表現(xiàn)［5］。目前認為老齡是唯一明確的POCD的危險因素，手術(shù)創(chuàng)傷可能是主要的原因［6］。通過研究發(fā)現(xiàn)老齡鼠腦內(nèi)存在腦神經(jīng)元大量凋亡的現(xiàn)象，而這種神經(jīng)細胞數(shù)量的減少可能是引起腦老化性認知功能障礙的重要原因。同時研究已經(jīng)證實細胞凋亡是包括阿爾茨海默?。ˋD）在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病的一個共同的病理特征［7-8］。但細胞凋亡機制是否與POCD相關(guān)還有待于進一步研究。本研究模擬臨床手術(shù)過程，通過對老年小鼠行肝部分切除術(shù)，觀察手術(shù)創(chuàng)傷所致老齡小鼠認知功能的下降與海馬神經(jīng)元凋亡的關(guān)系及尼莫地平的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選擇健康的18～20月齡C57BL雌性老齡小鼠，許可證號XC-XK（京）2012-0001，購自北京維通利華公司。實驗過程符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》及倫理要求。將小鼠隨機分為3組：對照組（C組）、手術(shù)組（S組）和尼莫地平組（Nimo組），每組各12只。C組小鼠不做任何特殊處理，S組小鼠在麻醉后行肝部分切除術(shù)，Nimo組小鼠手術(shù)與S組相同，于術(shù)前1 d開始腹腔注射尼莫地平（拜耳公司生產(chǎn)，批號：國藥準字J20100002，50 mL/10 mg）0.2 mg/（kg·d），每日1次。

1.2 手術(shù)模型建立

肝部分切除術(shù)具體步驟：10%水合氯醛麻醉后，手術(shù)切口處備皮，消毒，上腹部正中做一小切口，游離切除左側(cè)部分肝臟，用75%酒精棉球壓迫止血，傷口用0.25%布比卡因浸潤止痛，用縫線縫合傷口，并予以抗生素敷于傷口，所有手術(shù)步驟均為無菌操作。后將老鼠移至溫箱蘇醒，蘇醒后放回籠子中各自飼養(yǎng)。

1.3 實驗動物的認知功能檢測

T迷宮檢測是在T字型的迷宮中尋找食物以檢測動物對食物的空間工作記憶情況。術(shù)后3 d行T迷宮檢測，實驗過程中，小鼠控制飲食，但可自由飲水。每只小鼠均予訓(xùn)練5個實驗，每個實驗包括一個預(yù)備實驗與一個正式實驗。預(yù)備實驗將其中的一個臂關(guān)閉，允許小鼠進入來獲取食物，取食結(jié)束后，小鼠放回起始區(qū)，停留大約10 s之后，進行正式實驗測試。正式實驗時將起始臂和目標臂同時打開。若小鼠的選擇是未曾進入的臂，則為正確選擇，可獲得食物獎勵。若小鼠重復(fù)進入了相同的臂，為錯誤選擇，將不予以獎勵。實驗間隔為10 min。延長預(yù)備實驗和正式實驗間的時間間隔至90、180 s來測試，檢測術(shù)后3 d小鼠的空間工作記憶能力。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察

術(shù)后第3天心臟灌注固定后處死動物，各組動物摘取雙側(cè)海馬，使用4%多聚甲醛及2.5%戊二醛固定，常規(guī)方法來制備石蠟及電鏡切片，進行Nissel染色，分別進行光鏡與電鏡的觀察。

1.5 免疫組化染色

對各組海馬組織凋亡相關(guān)蛋白Fas、FasL進行染色。Fas、FasL一抗為兔抗小鼠IgG，二抗為生物素標記的山羊抗兔IgG。染色法按免疫組化試劑盒說明進行操作。以胞漿出現(xiàn)棕黃色染色為陽性，染色陰性對照以PBS代替一抗。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)的分析處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間的比較采用Student t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尼莫地平對術(shù)后小鼠認知功能的影響（T迷宮）

通過檢測10、90、180 s的延緩間隔，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后3 d S組小鼠的正確率與C組比較明顯降低（P＜0.05）；而Nimo組小鼠的正確率與S組小鼠比較明顯改善（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組實驗動物的空間記憶能力變化（T迷宮）

2.2 尼莫地平對手術(shù)小鼠形態(tài)學(xué)的影響

Nissel染色結(jié)果可見術(shù)后3 d海馬區(qū)存活的神經(jīng)元細胞數(shù)量減少，神經(jīng)胞質(zhì)顏色變淺，尼氏小體模糊、消散。Nimo組小鼠海馬區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)量增多。電鏡下發(fā)現(xiàn)術(shù)后3 d的S組小鼠海馬神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞有核固縮、核內(nèi)染色質(zhì)邊集、線粒體腫脹以及電子密度減低等改變，經(jīng)過尼莫地平治療后，可見神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的形態(tài)相對完整，而且線粒體腫脹減輕。見圖2、3（封四）。

2.3 尼莫地平對手術(shù)小鼠海馬凋亡蛋白Fas/FasL表達的影響

與C組比較，術(shù)后3 d S組小鼠海馬Fas/FasL表達增加（P＜0.01），而與S組比較，Nimo組小鼠海馬Fas/FasL表達明顯降低（P＜0.01）。見圖4～6（圖4、5見封四）。

圖6 Fas/FasL免疫組化IOD值分析

3 討論

目前POCD的發(fā)病機制存在多種學(xué)說，研究發(fā)現(xiàn)，老年性癡呆Aβ學(xué)說和Tau蛋白磷酸化學(xué)說參與了POCD的發(fā)?。?］，推測POCD與AD可能存在相同的發(fā)病機制。細胞凋亡是AD的發(fā)病機制之一，然而，細胞凋亡與POCD的關(guān)系尚未見報道。

細胞凋亡是體內(nèi)維持自身生理狀態(tài)相對穩(wěn)定的重要調(diào)節(jié)機制之一，發(fā)生異常增加或減少均可導(dǎo)致組織器官的結(jié)構(gòu)或功能改變。目前研究認為細胞凋亡主要有死亡受體途徑（外源性途徑）、線粒體途徑與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑（內(nèi)源性途徑）［10］。本研究主要討論死亡受體途徑，F(xiàn)as系統(tǒng)是一類與凋亡有關(guān)的基因，是位于細胞膜上的一個受體，屬于Ⅰ型膜蛋白，由胞外區(qū)、穿膜區(qū)、胞漿區(qū)組成，具有含2～5個半胱氨酸的細胞外重復(fù)序列與細胞內(nèi)死亡區(qū)域（DD），DD是轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞凋亡信號所不可或缺的，其對應(yīng)物的死亡配體為FasL。受體與配體特異性結(jié)合可經(jīng)死亡域傳導(dǎo)死亡信號從而介導(dǎo)細胞凋亡。

本實驗主要探討了手術(shù)創(chuàng)傷對老齡小鼠海馬區(qū)凋亡蛋白Fas/FasL的表達影響以及經(jīng)尼莫地平治療后對術(shù)后認知功能的改善作用與機制，結(jié)果表明手術(shù)創(chuàng)傷可導(dǎo)致實驗鼠海馬區(qū)凋亡蛋白Fas/FasL表達的增加，而在給予尼莫地平治療后S組小鼠的認知功能明顯改善，海馬神經(jīng)元損傷減輕，伴有海馬區(qū)Fas/ FasL表達的減少，因此，本實驗發(fā)現(xiàn)細胞凋亡可能參與了POCD的發(fā)病，而尼莫地平可能通過抑制細胞凋亡發(fā)揮對POCD的神經(jīng)保護作用。

尼莫地平為1，4二氫喲啶衍生物，是繼維拉帕米、硝苯地平之后的第二代鈣通道阻滯劑，也廣泛用于治療腦血管病及認知障礙性疾病等。其半衰期為2 h，注射1 mg/kg后腦內(nèi)濃度在15 min達高峰。電生理研究發(fā)現(xiàn)，尼莫地平可選擇性地與L型Ca2+通道結(jié)合，有較高的脂溶性，極易通過血腦屏障，在腦中較其他Ca2+通道阻滯劑有更大的容積分布及較強的受體親和力［11］。尼莫地平可降低細胞內(nèi)鈣超載，減少氧自由基產(chǎn)生，改善缺血區(qū)腦循環(huán)，抑制細胞凋亡［12］。

本研究結(jié)果為POCD發(fā)病機制的研究及新的靶向治療奠定了理論基礎(chǔ)。

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Study on effects and mechanism of Nimodipine on cognitive function in partial hepatectomized mice

ZHANG XunTANG YingLI WanZHANG Rongwei▲
Department of Geriatric Neurology,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Liaoning Province, Shenyang110001,China

ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism of Nimodipine on partial hepatectomized mice.MethodsThirty six healthy male C57BL/6 mice aged 18-20 months were randomly divided into 3 groups:control group(group C,n=12),without any special treatment;the surgery group(group S,n=12),with partial hepatectomy after anesthesia in mice;Nimodipine group(group Nimo,n=12),the mice in group Nimo and group S were in the same operation,intraperitoneal injection of Nimodipine was started 1 day before surgery,mice were sacrificed at 3 days after surgery in each group,and hippocampus were moved quickly.T-maze assay was used to detect the ability of learning and memory of the experimental mice 3 days after surgery;and Nissel staining and transmission electron microscopy was used to observe the change of hippocampal neuron survival quantity and ultrastructure in experimental mice;immunohistochemical method was used to detect the expression of Fas and FasL protein in the hippocampus of experimental mice.ResultsCompared with group C,the cognitive function of group S declined significantly on three days after surgery(P＜0.05);compared with the group S,group Nimo could improve the cognitive function on three days after surgery(P＜0.05).Nissel staining showed that the quantities of hippocampal neurons increased significantly on 3 days after surgery in group Nimo;the transmission electron microscopy showed there was a mild ultrastructure change of hippocampal tissues on three days after surgery in group Nimo.The expression of Fas and FasL in hippocampal tissues of mice in group Nimo showed a decrease on three days after surgery compared with group S(P＜0.01).ConclusionNimodipine can improve postoperative cognitive function by inhibiting the hippocampal neuron apoptosis mediated by Fas/FasL in aged mice.

Nimodipine;Partial hepatectomy;Cognitive function;Fas;FasL

R657

A

1673-7210（2015）07（a）-0004-03

2015-02-17本文編輯：張瑜杰）

國家自然科學(xué)基金資助項目（81100889）。▲