代文俊，朱彥卓，晁朝霞，任燕萍

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

新牧1號(hào)苜?？鼓嫦嚓P(guān)基因MvNHX1啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建

代文俊，朱彥卓，晁朝霞，任燕萍

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

為了進(jìn)一步研究新牧1號(hào)苜?？鼓嫦嚓P(guān)基因Mv N H X1啟動(dòng)子的功能，采用雙酶切的方法，用核酸內(nèi)切酶S acⅠ和N c oⅠ分別雙酶切p C AM B IA1304質(zhì)粒和陽性重組質(zhì)粒p E A S Y-T1-simple-pMv N H X1，然后回收目的片段。通過T4DN A連接酶將目的片段和空載體相連后獲得連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入到宿主菌D H5α，通過畫板，卡那霉素篩選后挑單菌落搖菌。然后用菌液PC R及雙酶切鑒定該載體后，用凍融法將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌E H A105。結(jié)果表明，成功培養(yǎng)出含有抗逆相關(guān)基因Mv N H X1啟動(dòng)子pMv N H X1∶G U S∶E H A105的菌落；成功構(gòu)建出新的植物表達(dá)載體pMv N H X1∶G U S。

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；Mv N H X1啟動(dòng)子；表達(dá)載體構(gòu)建

啟動(dòng)子在基因表達(dá)調(diào)控過程中起著重要作用[1]。植物基因啟動(dòng)子的克隆及其功能的研究有助于了解基因表達(dá)調(diào)控模式和信號(hào)傳遞途徑，同時(shí)可應(yīng)用于基因工程中調(diào)控目的基因的表達(dá)。目前植物基因工程中廣泛應(yīng)用的組成型啟動(dòng)子能高效、非特異地啟動(dòng)外源基因表達(dá)，外源基因在組成型啟動(dòng)子的調(diào)控下在植物的所有生長發(fā)育階段和所有組織中都高效表達(dá)，但是這往往會(huì)造成植物的代謝負(fù)荷，從而影響植物的長勢和產(chǎn)量。因此，由于信號(hào)刺激而具有轉(zhuǎn)錄活性的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在植物組織器官中定時(shí)、定點(diǎn)表達(dá)的組織特異性啟動(dòng)子已逐漸成為研究的熱點(diǎn)[2-3]。

以成功克隆的新牧1號(hào)苜?？鼓嫦嚓P(guān)基因M vNHX1啟動(dòng)子為研究對(duì)象[4]，采用分子生物學(xué)研究方法，構(gòu)建由M vNHX1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體，為利用MvNHX1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)，進(jìn)而了解M vNHX1啟動(dòng)子的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物表達(dá)載體pCAMBIA1304、大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105、限制性內(nèi)切酶SacⅠ和NcoⅠ、T4DNA連接酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、引物等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 M vNHX1啟動(dòng)子目的片段獲得 以含有目的片段的pEASY-T1-pMvNHX1質(zhì)粒為模板，使用上游引物NS1（5’-CGAGCTCTTGGAAGCTGGCATGGAG GATG-3’）和下游引物NA1（5’-CATGCCATGGGG CAATGGGCACTGATGACTGG-3’）擴(kuò)增得到帶有SacⅠ和NcoⅠ雙酶切位點(diǎn)的啟動(dòng)子片段，回收并純化。

1.2.2 植物表達(dá)載體pMvNHX1:GUS構(gòu)建 將植物表達(dá)載體pCAMBIA1304用SacⅠ和NcoⅠ雙酶切，去除CaMV35S啟動(dòng)子片段。酶切后獲得的MvNHX1啟動(dòng)子目的片段與酶切后的植物表達(dá)載體pCAMBI A1304進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系為25μL（10×T4Buffer為2.5μL，M vNHX1啟動(dòng)子目的片段為6μL，pCAMBIA1304目的片段為5μL，T4 DNA連接酶為1μL，加水至25μL），16℃反應(yīng)25 h。將連接后的植物表達(dá)載體pMvNHX1:GUS轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，涂抹于含有卡那霉素（50μg/m L）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，參照全式金質(zhì)粒小提試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取。使用菌液PCR和雙酶切鑒定構(gòu)建出的新的植物表達(dá)載體。

1.2.3 植物表達(dá)載體pM vNHX1:GUS轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 首先活化農(nóng)桿菌EHA 105至其OD600約為0.6，制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，然后將重組質(zhì)粒pMvNHX1::GUS轉(zhuǎn)入進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞中，接種于YEB固體平板上（含50 μg/mL卡那霉素和50μg/m L利福平），28℃培養(yǎng)24 h，待平板長出單菌落后挑取搖菌，進(jìn)行菌液PCR和雙酶切鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

用核酸內(nèi)切酶 NcoⅠ和 SacⅠ分別雙酶切pCAMBIA1304質(zhì)粒和陽性重組質(zhì)粒 pEASY-T1-simple-pMvNHX1。然后回收目的片段，將目的片段和空載體相連后獲得連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入到宿主菌Trans-T1，通過畫板，卡那霉素篩選后挑單菌落，搖菌和提質(zhì)粒，最終用內(nèi)切酶NcoⅠ和SacⅠ進(jìn)行單雙酶切檢測，雙酶切產(chǎn)生約11 559 bp和1 378 bp的預(yù)期片段，單酶切產(chǎn)生約12 937 bp的預(yù)期片段（圖1）。研究表明，MvNHX1啟動(dòng)子已成功插入到pCAMBI A1304上的多克隆位點(diǎn)，已成功構(gòu)建出新的植物表達(dá)載體pM vNHX1:GUS。

圖1 植物表達(dá)載體pMvNHX1:GUS酶切電泳結(jié)果注：M1，D15000DN A標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；1，pMv N H X1:G U S雙酶切；2，pMv N H X1:G U S單酶切

2.2 含植物表達(dá)載體農(nóng)桿菌陽性菌株的PCR檢測

對(duì)轉(zhuǎn)pMvNHX1:GUS的農(nóng)桿菌質(zhì)粒用MvNHX1啟動(dòng)子的特異引物擴(kuò)增出預(yù)期大小的條帶（圖2）。說明植物表達(dá)載體pMvNHX1:GUS都已成功地轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105菌株中。

圖2 農(nóng)桿菌pM vNHX 1:GUS轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定注：M，D2000DN A標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；1～3，Mv N H X1啟動(dòng)子PC R擴(kuò)增產(chǎn)物

3 結(jié)論與討論

以前期克隆得到的新牧1號(hào)苜?？鼓嫦嚓P(guān)基因MvNHX1啟動(dòng)子為研究對(duì)象，采用分子生物學(xué)研究方法，成功構(gòu)建獲得由MvNHX1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體pMvNHX1:GUS，為利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將MvNHX1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草中，通過GUS化學(xué)組織染色分析不同脅迫處理下GUS表達(dá)活性，進(jìn)而研究MvNHX1啟動(dòng)子的功能奠定基礎(chǔ)。

前期研究結(jié)果表明，新牧1號(hào)苜蓿受高鹽和干旱的誘導(dǎo)產(chǎn)生抗逆相關(guān)基因MvNHX1，因此，進(jìn)一步采用基因工程技術(shù)，揭示新牧1號(hào)苜蓿MvNHX1誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子生物學(xué)功能，其結(jié)果不僅可為苜蓿轉(zhuǎn)基因工程提供可用的內(nèi)源啟動(dòng)子，為苜蓿啟動(dòng)子研究奠定基礎(chǔ)，而且可豐富和拓寬耐鹽基因工程可用基因和啟動(dòng)子資源庫，促進(jìn)我國廣大鹽漬化地區(qū)的開發(fā)和利用。

[1]王 穎，麥維軍，梁承鄴，等.高等植物啟動(dòng)子的研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào)，2003，23：2040-2048.

[2]楊春霞，陳 英，黃敏仁，等.擬南芥逆境誘導(dǎo)性啟動(dòng)子r d29A的克隆及活性檢測[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，32（1）：6-10.

[3]楊 梅，熊立仲.水稻干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子O s h o x24P的分離與鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30（5）：525-531.

[4]楊云堯，任燕萍，蘇豫梅，等.新牧1號(hào)苜蓿兩個(gè)抗逆相關(guān)基因啟動(dòng)子的克隆及分析[J].草業(yè)科學(xué)，2012，29（12）：1887-1893.

（責(zé)任編輯：盧紅玲）

Construction of Plant Expression Vector of M vNHX1 Promoter in M.varia Xinmu1

DAIWen-jun，ZHU Yan-zhuo，CHAO Zhao-xia，REN Yan-ping
（College of Agriculture,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,PRC;Key Lab of Agricultural Biotechnology, Xinjiang Agricultural University,Urumqi830052,PRC）

In order to clarify stress-inducible M vNHX1 promoter function in M edicago varia X inmu 1,the M vNHX 1 promoter and plant expression vector pCAMBIA1304 were digested w ith SacⅠand NcoⅠ by using co-digestion.Then the purified MvNHX1 promoter fragment was connected to the plant expression vector pCAMBIA1304 w ithout 35S promoter by T4 DNA ligase.Finally the pCAMBIA1304 containing M vNHX1 promoterwas successfully transferred into Agrobacterium tumefaciens EHA105.The transfered A. tumefaciens EHA105 w ith pM vNHX 1∶GUSwas identified by PCR and enzyme digestion.

inducible promoter;MvNHX1 promoter;construction of plantexpression vector

Q78

A

1006-060X（2015）01-0004-02

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.01.002

2014-10-24

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（jqz tp72013009）

代文?。?991-），女，河南沈丘縣人，在讀本科，主要學(xué)科專業(yè)為生物技術(shù)。

任燕萍