曹 佳，宋思思，李曉剛，劉一平，楊雪清

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，湖南 長沙410128；2.湖南省生物農(nóng)藥與制劑加工工程技術研究中心，湖南 長沙410128；3.湖南省農(nóng)藥檢定所，湖南 長沙410005；4.湖南京西祥隆化工有限公司，湖南 株洲412005）

殺螺胺乙醇胺鹽原藥的反相高效液相色譜測定

曹 佳1,2，宋思思1,2，李曉剛1,2，劉一平3，楊雪清4

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，湖南 長沙410128；2.湖南省生物農(nóng)藥與制劑加工工程技術研究中心，湖南 長沙410128；3.湖南省農(nóng)藥檢定所，湖南 長沙410005；4.湖南京西祥隆化工有限公司，湖南 株洲412005）

利用反相高效液相色譜法研究了兩種色譜柱，3種流動相對殺螺胺乙醇胺鹽分離效果的影響，并對測定方法進行比較。結果表明，以S purs i lTMC18為色譜柱，流動相為甲醇︰水︰三乙胺=90︰10︰0.1（V/V）時，測定值的標準偏差為0.185，變異系數(shù)為0.240%，平均回收率為97.12%，線性相關系數(shù)為0.999 9。這說明在該條件下殺螺胺乙醇胺鹽的分離效果較好，同時該方法簡單快捷，可作為分析殺螺胺乙醇胺鹽原藥的分析方法。

殺螺胺乙醇胺鹽；氯硝柳胺；高效液相色譜法；三乙胺

殺螺胺乙醇胺鹽又名氯硝柳胺乙醇胺鹽，屬酰胺類殺軟體動物劑，具有胃毒作用，對螺卵、血吸蟲尾蚴等有較強的殺滅作用，是WHO推薦使用的滅螺藥[1-2]。近年來，國內(nèi)外對殺螺胺乙醇胺鹽的加工應用[3]、殺螺活性[4]、殘留[5-6]及環(huán)境毒理[7]進行了大量研究報道。目前，國內(nèi)外已報道的殺螺胺乙醇胺鹽分析方法有電位滴定法[8]、分光光度計法[9]和高效液相色譜法[10-12]。但是，電位滴定法和分光光度計法的分析時間較長、雜質(zhì)分離效果不佳。高效液相色譜法是用于檢測殺螺胺乙醇胺鹽的常用方法，在實際檢測中，相同的色譜條件下，不同廠家生產(chǎn)的色譜柱對殺螺胺乙醇胺鹽的分離效果有差異，有的甚至達不到分離要求，而在研究制定高效液相色譜方法時，選擇適宜的流動相也很重要。因此，試驗擬采用反相高效液相色譜法，篩選不同的色譜柱及流動相，以期建立較為完善的殺螺胺乙醇胺鹽原藥測定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試儀器設備主要有島津LC-20AT高效液相色譜儀，配備LC-20AT泵、20μL定量環(huán)以及紫外檢測器和LC-solution色譜工作站；色譜柱：SpursilTMC18（250mm×4.6mm，5μm，北京迪科馬科技有限公司）、C18-WP（250mm×4.6 mm，5μm，德國CNW科技公司）；超聲波清洗器；濾膜孔徑0.45μm的過濾器。試驗主要試劑有甲醇（色譜純）、超純水、三乙胺（分析純），殺螺胺標樣（已知質(zhì)量分數(shù)≥99%，某公司），殺螺胺原藥（湖南京西祥隆化工有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液及試樣的配制 （1）標準溶液配制。準確稱取殺螺胺標準品0.020 0 g于50ML容量瓶中，加入適量甲醇試劑溶解，置于超聲浴槽中約10 Min，取出降至室溫后，用甲醇補至刻度線搖勻，再用0.45μm濾膜過濾后備用。（2）試樣配制。準確稱取殺螺胺乙醇胺鹽0.020 0 g，操作同（1）。

1.2.2 流動相的影響 以SpursilTMC18為色譜柱，分離條件為柱溫25℃，檢測波長230 nm，進樣量10 μL，當流動相分別為甲醇︰水=90︰10（V︰V，下同）、甲醇︰水︰三乙胺=90︰10︰0.1、甲醇︰水︰三乙胺=54︰46︰0.115時，對流動相的影響進行分析。1.2.3 色譜柱的影響 在流動相為甲醇︰水︰三乙胺=90︰10︰0.1、柱溫為25℃、檢測波長230 nm、流速1.0ML/Min、進樣量10μL時，分別采用以SpursilTMC18和Athena C18-WP兩種色譜柱，對色譜柱影響進行分析。

1.2.4 測定 在1.2.2和1.2.3下，待儀器基線穩(wěn)定后連續(xù)注入數(shù)針標準溶液，直至相鄰兩針的峰面積變化小于1.5%，按標準溶液、試樣溶液、試樣溶液、標準溶液的順序進行測定。

1.2.5 對色譜條件的檢測 （1）線性關系檢測。稱取一定量的殺螺胺標準品，用甲醇配制一定質(zhì)量濃度的殺螺胺標準溶液，再用梯度稀釋法配制成質(zhì)量濃度分別為0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00mg/L的標準工作液，按條件進行反相高效液相色譜測定。以殺螺胺標準工作液的質(zhì)量濃度（x，mg/L）對其所對應的色譜峰面積（y）做標準曲線，得到相應的線性關系曲線。（2）精密度檢測。對同一樣品分別進行5次重復測定，考查樣品回收率的標準偏差及變異系數(shù)。（3）準確度檢測。稱取5份已知準確含量的殺螺胺乙醇胺鹽試樣，分別加入一定量的殺螺胺標準品，按條件進行重復測定，考查平均回收率。

1.2.6 計算 將測得的兩針試樣溶液和試樣溶液前后兩針標準溶液中的殺螺胺的峰面積分別進行平均。以質(zhì)量百分數(shù)表示的殺螺胺乙醇胺鹽的含量X按公式（1）計算：

式中：A1表示標準溶液中殺螺胺峰面積的平均值；A2表示試樣溶液中殺螺胺乙醇胺鹽峰面積的平均值；m1表示殺螺胺標樣的質(zhì)量（g）；P表示標準品中殺螺胺的質(zhì)量百分數(shù)（%）；1.186 8為殺螺胺換算成殺螺胺乙醇胺鹽系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 流動相影響

由圖1和圖2可知，以SpursilTMC18為色譜柱，當分別以甲醇︰水=90︰10和甲醇︰水︰三乙胺=90︰10︰0.1作為流動相時，殺螺胺乙醇胺鹽的保留時間分別為4.988Min和1.785Min，甲醇與水的比例一樣，但是加入三乙胺后，保留時間提前，并且避免了前沿峰。Huber[13]提出，三乙胺會和固定相上殘留的硅羥基結合，還會與C18發(fā)生疏水作用，可減弱溶質(zhì)與固定相的相互作用，促使溶質(zhì)更快地從固定相上被流動相洗脫。由于三乙胺的這種有機調(diào)節(jié)劑作用，在液相色譜分析中將其加入到流動相中，在減少樣品中堿性組分前沿的同時，對峰形和保留時間也有一定影響。

圖1 色譜柱SpursilTMC18

圖2 色譜柱SpursilTMC18（流動相為甲醇︰水︰三乙胺=90︰10︰0.1）

以甲醇︰水︰三乙胺=54︰46︰0.115為流動相時，從圖3中可以看出，樣品中的成分沒有完全分離。這與伍一紅[5]在殺螺胺乙醇胺鹽在水稻和稻田中的殘留及消解動態(tài)試驗的報道不一致。因此，在具體操作中，要使物質(zhì)得到較好地分離，使峰形、峰純度、分離度等達到要求，需要適當調(diào)整流動相比例。

2.2 色譜柱影響

圖3 色譜柱SpursilTMC18（流動相為甲醇︰水︰三乙胺=54︰46︰0.115）

當流動相及分離條件相同時，分別以SpursilTMC18和Athena C18-WP作為色譜柱，從圖2和圖4中可以看出，樣品出峰的時間分別為1.785Min和2.167 Min，峰形也都尖銳、對稱。兩根色譜柱都是高純度硅膠基質(zhì)液相色譜柱，但對殺螺胺乙醇胺鹽的分離效果卻不同，這可能是因為固定相的制備重復性偏差，或不同廠家生產(chǎn)的色譜柱在填料的粒度分布、原材料、硅膠基質(zhì)表面積等方面均有差異，從而引起保留值的變化。色譜柱表面積增加，則有機相的量與保留值均有所提高，而且硅膠基質(zhì)表面的硅羥基濃度差異，也能引起保留值及分離選擇性的不同[14-15]。

2.3 色譜條件的檢測

2.3.1 線性關系 由表1可知，色譜柱為SpursilTMC18，流動相為甲醇︰水︰三乙胺=90︰10︰0.1時，線性相關系數(shù)為0.999 9，高于另外兩種方法，線性關系最好。

圖4 色譜柱Athena C18-WP（流動相為甲醇︰水︰三乙胺=90︰10︰0.1）

2.3.2 精密度 由表 2可知，色譜柱為SpursilTMC18，流動相為甲醇︰水︰三乙胺=90︰10︰0.1時，標準偏差為0.185，變異系數(shù)為0.240，均低于另外兩種方法，精密度最高。

2.3.3 準確度 由表3可知，色譜柱SpursilTMC18、流動相甲醇︰水︰三乙胺=90︰10︰0.1時，平均回收率高于另外兩種方法，準確度最高。

表1 3種色譜條件線性關系的比較

表2 3種色譜條件精密度的比較

表3 3種色譜條件準確度的比較

3 結論

試驗結果表明，在流動相中添加適當?shù)母男詣┤野?，使保留時間提前，分析時間縮短，同時避免了前沿峰，分離效果好。因此，甲醇︰水︰三乙胺=90︰10︰0.1的流動相分離殺螺胺乙醇胺鹽的效果更好。

使用不同廠家生產(chǎn)的色譜柱對殺螺胺乙醇胺鹽的檢測效果有差別，這與色譜柱生產(chǎn)廠家填料等因素有關。因此，在檢測分析殺螺胺乙醇胺鹽時，色譜柱的選擇也需要特別注意，合適的色譜柱可以得到更可信的結果。研究結果表明，色譜柱SpursilTMC18比色譜柱Athena C18-WP分離殺螺胺乙醇胺鹽的效果要好。

綜上所述，色譜柱為SpursilTMC18，流動相為甲醇︰水︰三乙胺=90︰10︰0.1時，殺螺胺乙醇胺鹽的分離效果好，準確度較高，可以作為分析殺螺胺乙醇胺鹽原藥的定量分析方法。

[1] WHO/SCHISTO/92. The role of mollusciciding in schistosomiasis control division of control of tropical disease[R]. Geneva：Switzerland，1992.

[2]陳 昌.我國的殺螺劑及其應用[J].中國血吸蟲病防治雜志，2003，15（5）：321-322.

[3] 方益民，黃軼盺.氯硝柳胺乙醇胺鹽粉劑的應用[J].中國血吸蟲病防治雜志，2007，19（5）：398-400.

[4]姜 柳，李樹風，李新松，等.氯硝柳胺乙醇胺鹽納米劑的制備與殺螺效果[J].中國血吸蟲病防治雜志，2006，19（2）：102-106.

[5]伍一紅，龔道新，張素芳，等.殺螺胺乙醇胺鹽在水稻和稻田中的殘留及消解動態(tài)[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2012，31（2）：278-283.

[6] 嚴相平，王康蕊，王浦海，等.H P L C法測定泥土中氯硝柳胺的含量[J].農(nóng)藥，2011，50（5）：350-351.

[7] 王 飛，戴建榮.氯硝柳胺的毒理學安全性評價研究概況[J].中國人獸共患病學報，2013，29（1）：86-90.

[8]金良正，曹麗軍，裘淑華，等.魚塘污染滅螺劑氯硝柳胺的快速化學鑒別[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17（8）：1440-1441.

[9]姜友富，王 俊，嵇正平，等.氯硝柳胺現(xiàn)場檢測方法和檢測儀的研究與開發(fā)[J].中國血吸蟲病防治雜志，2009，21（3）：209-211.

[10]林自建，陳茹娟.氯硝柳胺乙醇胺鹽高壓液相色譜分析[J].四川化工與腐蝕控制，2000，2（3）：9-10.

[11]楊俊柱，朱傳明.50%氯硝柳胺乙醇胺鹽可濕性粉劑的高效液相色譜測定[J].農(nóng)藥科學與管理，2006，25（7）：12-14.

[12]孫 海，陳岸燕，余曉峰，等.農(nóng)藥產(chǎn)品中貝螺殺乙醇胺鹽的高效液相色譜分析[J].浙江化工，2008，39（12）：25-26.

[13] Huber C G.Micropellicular stationary phases for high-performance liquid chromatography of double-stranded DNA[J]. Journal of ChromatographyA，1998，806（1）：3-30.

[14]張慶合.高效液相色譜實用手冊[M].北京：化學工業(yè)出版社，2008. 78.

[15] McCalley D V. Study of the selectivity，retention mechanisms and performance of alternative silica-based stationary phases for separation of ionised solutes in hydrophilic interaction chromatography[J]. Journal of Chromatography A，2010，1217（20）：3408-3417.

DeterMination of NiclosaMide EthanolaMine Salt by RP-HPLC

CAO Jia1,2，SONG Si-si1,2，LIXiao-gang1,2，LIU Yi-ping3，YANG Xue-qing4
（1.College of Plant Protection,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,PRC;2.Hunan Provincial Engineering&Technology Research Center for Bio-pesticide and Formulating Processing,Changsha 410128,PRC;3.Hunan Agrochemicals Control Institute, Changsha 410005,PRC;4.Hunan Jingxi Lung Cheung Chemical Industry Co.,Ltd,Zhuzhou 412005,PRC）

In order to analyze the influence of tw o kinds of chromatographic column,three typesofmobile phase on the separating effect of NiclosaMide ethanolaMine salt,RP-HPLC wasused.The results showed thatw hen the chromatographic column was SpursilTMC18,and themobile phase ofmethanol,waterand trimethylaminewas90︰10︰0.1（V/V）,the standard deviation ofmeasured valuewas 0.185, the variable coefficientwas0.240%,the average recovery rate w as 97.12%and the linearly dependent coefficientwas0.999 9.Therefore, we can conclude thatunder this condition the Niclosamide ethanolaMine salt had good separating effect,and themethod can be used to measure theactive compound ofNiclosamideethanolaminesaltbecauseof itssimpleand rapid.

NiclosaMideethanolamine salt;Niclosamide;HPLC;triethylamine

TQ450.7

A

1006-060X（2015）04-0102-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.032

2015-03-13

湖南省自然科學基金資助項目（13JJ5023）；湖南省高等學?？茖W研究重點項目（11A053）

曹 佳（1990-），女，湖南郴州市人，碩士研究生，主要從事農(nóng)藥殘留分析與環(huán)境行為研究。