王 娟，梁運姍，王 智

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

RNA-seq技術(shù)鑒定Bt水稻對擬環(huán)紋豹蛛腸道基因表達(dá)的影響

王 娟，梁運姍，王 智

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

為了探究Bt水稻對擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)基因表達(dá)水平的影響，利用Illumina 2000測序平臺對蜘蛛腸道進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序并分析其基因表達(dá)情況，從分子角度揭示Bt水稻的生物安全性。對腸道測序共獲得65 028 186條clean reads，經(jīng)Trinity軟件拼接得到135 829 條長度大于200 bp的Unigene用于整個轉(zhuǎn)錄組分析。用FPKM法計算2個樣本中基因的表達(dá)量，并以負(fù)二項分布檢驗法分析其顯著性。結(jié)果顯示，富集Bt的擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)相對于正常蜘蛛顯著差異表達(dá)的基因有142個，包括1個下調(diào)141個上調(diào)，并且其差異表達(dá)倍數(shù)都在8倍以上（FDR＜0.05，Log2Ration＞2）。利用Blast程序?qū)⒉町惢蚺cCOG, GO和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對差異基因進(jìn)行功能注釋。注釋結(jié)果描述的酶、生物學(xué)過程和代謝途徑與細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)能反應(yīng)相關(guān)，如細(xì)胞色素c氧化酶，氧化磷酸化等。推測Cry1Ab 可能對擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)有一定的影響。

Cry1Ab蛋白；擬環(huán)紋豹蛛；腸道；轉(zhuǎn)錄組

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，在我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位[1]。同時，水稻也是我國蟲害問題最為嚴(yán)重的作物之一，科學(xué)解決水稻蟲害問題對于提高水稻產(chǎn)量十分重要。近年來，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻（Bt水稻）的出現(xiàn)為緩解水稻蟲害問題提供了新的方向，它能夠特異性殺死靶標(biāo)生物鱗翅目和鞘翅目等害蟲，減少殺蟲劑的使用，提高水稻產(chǎn)量。研究表明Bt水稻中的Bt毒蛋白可以沿著食物鏈傳遞，并在植食者和捕食者體內(nèi)發(fā)生一定程度的富集，這樣，水稻田中的非靶標(biāo)生物也可能受到Bt毒蛋白的影響[2]。此時，評估稻田中非靶標(biāo)節(jié)肢動物的安全性成為Bt水稻安全性評估必不可少的一部分內(nèi)容。一方面，對Bt水稻田中節(jié)肢動物群落進(jìn)行長達(dá)2 a的調(diào)查統(tǒng)計顯示，Bt蛋白對稻田中植食類、寄生類、捕食類和腐食類動物的群落主要參數(shù)（物種豐富度，均勻性指數(shù)，優(yōu)勢集中性指數(shù)）、功能團(tuán)優(yōu)勢度和功能團(tuán)內(nèi)科組成及其優(yōu)勢基本無顯著的負(fù)面影響[3]。另一方面，從節(jié)肢動物個體上看，不同節(jié)肢動物對Bt蛋白的耐受性不一樣，受到的影響也不一樣，如轉(zhuǎn)Cry1C和Cry12A基因水稻不會影響植食者白背飛虱若蟲的發(fā)育歷期、存活率、雌蟲的體重以及成蟲的產(chǎn)卵量和卵孵化率[4]，而稻田優(yōu)勢種擬環(huán)紋豹蛛的發(fā)育歷期在Cry1Ab和Cry1Ac蛋白的作用下會顯著延長，且體內(nèi)部分保護(hù)酶谷胱甘肽過氧化物酶和乙酰膽堿酯酶也會受到一定影響[5-6]。然而，這些研究大都是從宏觀層面出發(fā)，反應(yīng)Bt水稻對非靶標(biāo)生物的影響，沒有從分子層面評估Bt水稻的安全性。因此，為了更全面的評估Bt水稻的安全性，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析非靶標(biāo)生物擬環(huán)紋豹蛛在Bt蛋白作用下腸道基因的表達(dá)情況，以期為Bt水稻的安全性評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試轉(zhuǎn)基因水稻和蟲源

轉(zhuǎn)Cry1Ab基因水稻汕優(yōu)63和對照組普通汕優(yōu)63水稻種子由湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。供試水稻種植在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院的獨立的天臺上。供試期間人工管理并不施用任何農(nóng)藥，并分為Bt試驗組水稻和對照組水稻，均使用尼龍網(wǎng)圈圍（3 m × 2 m × 1 m）。試驗期間兩組水稻分別培養(yǎng)，互不干擾。稻飛虱采自湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院常規(guī)實驗水稻田，未施用農(nóng)藥。采集稻飛虱成蟲帶回尼龍網(wǎng)水稻品種上飼養(yǎng)，分為試驗組和對照組，建立實驗種群。收集取食水稻15 d的褐飛虱作為擬環(huán)紋豹蛛的食物[7]。

1.2 供試蜘蛛

從湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院常規(guī)實驗水稻田中（未施用農(nóng)藥）采集的大小均一的擬環(huán)紋豹蛛成蛛飼養(yǎng)在玻璃指管中，玻璃指管中放入一小團(tuán)濕潤的棉球以提供蜘蛛所需水源，每只蜘蛛每天喂食20只褐飛虱。待蜘蛛捕食飛虱3、6、9、12 d后取出蜘蛛測量Cry1Ab蛋白在蜘蛛體內(nèi)的富集量，取Cry1Ab蛋白最大富集量下的擬環(huán)紋豹蛛作轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 ELISA 檢測

所有待測蜘蛛勻漿后加入適量PBS緩沖液，12 000 r/min離心2 min，取上清液作為待測樣品備用。Cry1Ab蛋白含量測定采用Bt-Cry1Ab/Ac ELISA平板試劑盒（PathoScreen, 美國Agdia公司），根據(jù)說明進(jìn)行Cry1Ab含量測定。所有結(jié)果均由酶標(biāo)儀讀取，在波長450 nm下測定OD值，重復(fù)3次。設(shè)置Cry1Ab蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為2、4、8、16和24 ng/L。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

總共有40只擬環(huán)紋豹蛛用于解剖腸道，為防止RNA降解所有解剖均在冰面上進(jìn)行。解剖出的腸道用液氮速凍后加Trizol保存于-80℃冰箱中。所有樣品均送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

ELISA檢測的數(shù)據(jù)由SPSS17.0軟件進(jìn)行顯著性分析，采用單因素顯著性分析方法，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同天數(shù)下擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)Cry1Ab蛋白含量

如圖1所示，Cry1Ab蛋白含量在擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)是一種動態(tài)變化的狀態(tài)，其富集量從第三天的0.091 ng/g到第六天上升至0.13 8 ng/g，并且在第九天時達(dá)到最大富集量0.396 ng/g，然后又在第12天時下降到0.267 ng/g。這表明，Cry1Ab蛋白可以沿著食物鏈從水稻通過褐飛虱傳遞到擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)并在一定程度上富集。

圖1 Cry1Ab蛋白在擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)變化規(guī)律

2.2 擬環(huán)紋豹蛛腸道轉(zhuǎn)錄組測序分析

2.2.1序列拼接采用測序平臺Illumina 2000 對擬環(huán)紋豹蛛腸道轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，總共獲得65 028 186條clean reads，包含了6487 679 770個核苷酸序列信息。對所獲得的cleans reads 去冗余后用Trinity 軟件對reads進(jìn)行逐步拼接，最終得到Unigene。如表1所示，經(jīng)過de novo 拼接，總共得到135 829 條長度大于200 bp的Unigene，42 133條大于500 bp Unigene，19 217條大于1 000 bp的Unigene。此外，所有Unigene 的總長度為80 907 174 bp，平均長度為595.65 bp，N50值為874 bp。

2.2.2基因表達(dá)分析為了研究Cry1Ab蛋白對擬環(huán)紋豹蛛腸道基因表達(dá)水平的影響，用拼接得到的所有Unigene做庫，以FPKM法計算基因在各樣品中的表達(dá)量，然后采用DEGseq軟件包中的負(fù)二項分布檢驗計算基因差異表達(dá)量，并采用NB（負(fù)二項分布檢驗的方式）對reads數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗。以FDR＜0.05，Log2ratio ＞2 為篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選富集Cry1Ab蛋白的蜘蛛相對于正常蜘蛛顯著差異表達(dá)的基因。結(jié)果顯示，富集Cry1Ab蛋白擬環(huán)紋豹蛛的腸道基因中共有142個基因相對于正常組蜘蛛顯著差異表達(dá)，包括1個上調(diào)基因，141個下調(diào)基因。此外，所有顯著差異表達(dá)的基因均有較大幅度的表達(dá)水平變化，都在8～14倍之間。這表明，Cry1Ab的攝入對擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)某些基因的表達(dá)有較大的影響。

2.2.3差異基因功能注釋將篩選得到的差異表達(dá)基因利用Blast程序比對到COG，GO和KEGG 數(shù)據(jù)庫中，取匹配值最高的比對結(jié)果作為該基因的功能預(yù)測結(jié)果。142個差異表達(dá)基因中有30個差異基因在COG數(shù)據(jù)庫中有比對結(jié)果。這30個基因分別注釋到COG數(shù)據(jù)庫的16個子分類中，包括細(xì)胞色素c氧化酶，組蛋白，脂肪酸去飽和酶，阿爾法晶狀體蛋白等（表2）。據(jù)統(tǒng)計，COG注釋結(jié)果中細(xì)胞色素c氧化酶這一條目被較多的差異基因注釋到，被注釋的基因中有31%的差異基因的生物學(xué)功能是編碼細(xì)胞色素c氧化酶的，它們分別編碼細(xì)胞色素c氧化酶的一些亞基，包括亞基I、亞基II及相關(guān)蛋白、亞基III及相關(guān)蛋白。眾所周知，細(xì)胞色素c氧化酶是線粒體上電子傳遞末端的酶，對細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用，本研究中試驗組擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)編碼細(xì)胞色素c氧化酶的基因異常表達(dá)表明，Cry1Ab蛋白可能對蜘蛛腸道細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)有一定影響。

表2 差異表達(dá)基因COG注釋結(jié)果分類

對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋，結(jié)果顯示有34個顯著差異表達(dá)基因比對到GO數(shù)據(jù)庫的3個本體中。類似于COG注釋結(jié)果，有20.6%的差異基因的生物功能是跟發(fā)生在線粒體上的氧化還原反應(yīng)相關(guān)的，共涉及12種生物學(xué)過程，如電子傳遞鏈、線粒體內(nèi)膜、呼吸鏈、氧化磷酸化、電子載體活性、有氧呼吸和細(xì)胞色素c氧化酶活性等（表3）。這些注釋結(jié)果進(jìn)一步表明，Cry1Ab蛋白可能影響擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)線粒體上的一些氧化還原反應(yīng)。

此外，所有差異表達(dá)基因的KEGG注釋結(jié)果顯示，共有11個差異基因注釋到21條不同的代謝途徑中，而氧化磷酸化代謝途徑（ko00190）是被差異基因注釋到最多的代謝途徑，占所有被注釋的基因的23.8%。眾所周知，氧化磷酸化是生物體內(nèi)重要的能量傳遞反應(yīng)，它在真核生物線粒體內(nèi)通過氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生ATP為其他生理活動提供能量。調(diào)控氧化磷酸化代謝途徑的相關(guān)基因異常表達(dá)表明，Cry1Ab蛋白對擬環(huán)紋豹蛛腸道細(xì)胞內(nèi)線粒體的生物學(xué)功能有影響，即影響到線粒體的產(chǎn)能功能。

表3 差異表達(dá)基因GO注釋結(jié)果中與線粒體相關(guān)的生物學(xué)功能

3 結(jié)論與討論

Bt水稻作為一種新型的抗蟲水稻，它可以使Bt蛋白特異性作用在鱗翅目昆蟲的腸道上，破壞細(xì)胞膜的完整性，引起細(xì)胞滲透失衡，細(xì)胞膨脹并溶解，最終導(dǎo)致昆蟲死亡[8]。而擬環(huán)紋豹蛛作為稻田蜘蛛優(yōu)勢種，性情兇猛，個體較大，捕食性強(qiáng)，同樣對控制水稻田中害蟲種群數(shù)量有著十分重要的作用[9]，雖然是非靶標(biāo)生物，但Bt蛋白仍可能對擬環(huán)紋豹蛛產(chǎn)生不利影響。因此，研究利用高通量測序技術(shù)分析對擬環(huán)紋豹蛛在Bt蛋白作用下的基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，從分子層面揭示Bt水稻的安全性。

在研究中，通過Illunian2000測序平臺對蜘蛛腸道進(jìn)行測序獲得65 028 186條clean reads，再經(jīng)Trinity軟件de novo 拼接獲得135 829 條長度大于200 bp的Unigene用于后續(xù)分析。整個測序過程中獲得了超過6 G的數(shù)據(jù)量，是小菜蛾中腸轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)量的6倍[10]，相當(dāng)于亞洲卷葉螟整只轉(zhuǎn)錄組序列的1.3倍[11]，該次測序為擬環(huán)紋豹蛛腸道轉(zhuǎn)錄組研究提供了足夠的原始數(shù)據(jù)。

為了探究Cry1Ab 蛋白是否會影響擬環(huán)紋豹蛛腸道某些重要基因的表達(dá)水平，重點分析了富集Cry1Ab蛋白的擬環(huán)紋豹蛛相對于正常蜘蛛顯著差異表達(dá)的基因（FDR＜0.05，Log2Ration＞2）。共篩選得到142個顯著差異表達(dá)的基因，包括一個1下調(diào)，141個上調(diào)，所有差異基因的表達(dá)水平相對于正常水平都有8倍以上的變化，這意味著Cry1Ab蛋白會對擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)某些基因的表達(dá)產(chǎn)生較大的影響?；谙嗨菩员葘Φ脑?，對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，分別于COG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對（E value＜10-5），選擇匹配最好的一項作為注釋差異基因的注釋信息。

研究結(jié)果顯示，差異基因中有30個基因在COG數(shù)據(jù)庫中有比對結(jié)果，34個在GO數(shù)據(jù)庫中有比對結(jié)果，11個在KEGG 數(shù)據(jù)庫中有比對結(jié)果。其中，COG注釋結(jié)果顯示差異基因中有部分差異基因是編碼細(xì)胞色素c氧化酶的。細(xì)胞色素c氧化酶是細(xì)胞內(nèi)電子傳遞重要的末端調(diào)控酶，其相關(guān)基因的異常表達(dá)會影響到細(xì)胞內(nèi)某些氧化還原反應(yīng)。據(jù)此推斷，Cry1Ab蛋白對擬環(huán)紋豹蛛腸道細(xì)胞內(nèi)線粒體上的氧化還原反應(yīng)有不利影響。此外，將差異基因比對到KEGG數(shù)據(jù)庫中，在被注釋到的21條代謝通路中，氧化磷酸化代謝途徑是差異基因參與調(diào)控最多的代謝途徑。這從另一方面表明，Cry1Ab蛋白會影響到擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)線粒體的生物學(xué)功能，并且可能是通過影響線粒體上的產(chǎn)能反應(yīng)來阻礙線粒體功能的。除此之外，還有一些差異基因在KEGG注釋被認(rèn)為參與調(diào)控某些次級產(chǎn)物代謝途徑，包括甘油磷酸酯代謝、醚脂代謝、花生四烯酸代謝等。曾有研究顯示，當(dāng)比較正常小菜蛾與抗Bt蛋白小菜蛾中腸基因的表達(dá)情況時，小菜蛾體內(nèi)差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能在氧化還原酶活性這方面有富集，并且同樣有大量的基因參與調(diào)控某些次級代謝反應(yīng)[10]。因此，在擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)，大量差異基因編碼細(xì)胞色素c氧化酶，參與線粒體相關(guān)的生物學(xué)過程，調(diào)控氧化磷酸化代謝途徑，這些都可能跟蜘蛛對Cry1Ab毒蛋白的防御機(jī)制相關(guān)。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以直觀的反應(yīng)出生物體在某一狀態(tài)下基因的表達(dá)情況[12]，研究首次利用該技術(shù)分析了Cry1Ab蛋白作用下擬環(huán)紋豹蛛腸道基因的表達(dá)情況，從全新的角度評估了Bt水稻對非靶標(biāo)生物擬環(huán)紋豹蛛的生物安全性。

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（責(zé)任編輯：高國賦）

Effect of Bt Rice on Intestinal Gene Expressing of Pardosa pseudoannulata by RNA-seq Identification

WANG Juan，LING Yun-shan，WANG Zhi
（College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

In order to test the effect of Bt rice on the gene expression profle of wolf spider Pardosa pseudoannulata, the transcriptome of spider intestine was sequenced via Illunina 2000 sequencing platform and the gene expression was analyzed to reveal the safety of Bt rice at molecular level. In this study, all 65 028 186 clean reads were obtained from the sequencing, all 135 829 Unigene (＞200bp) were assembled by using Trinity software, and FPKM was utilized to quantify gene expression level in two samples and negative binomial distribution test was employed to analyze the significance. The results indicated that total 142 differential expression genes (DEGs) were detectable in Bt-containing spider as compared with non-Bt spider, including 1 down-regulated gene and 141 up-regulated genes. Besides, the change of all DEGs was higher than 8 folds (FDR＜0.05, Log2Ration＞2). To understand the biological function of DEGs, all DEGs were contrasted with COG, GO and KEGG databases with Blast program, the enzymes, biological processes and metabolism pathways described in the annotation results were involved in intracellular energy reaction, including cytochrome c oxidase, and oxidative phosphorylation pathway, implying Cry1Ab might have impacts on the expression level of genes related to energy metabolism inPardosa pseudoannulata.

Cry1Ab protein;Pardosa pseudoannulata; intestine; transcriptome

S636.2

：A

：1006-060X（2015）09-0001-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.09.001

2015-08-02

國家自然科學(xué)基金（31071943，31272339）；湖南省教育廳科學(xué)研究基金（10A054）

王 娟（1990- ），女，湖南岳陽市人，碩士研究生，研究方向為發(fā)育生物學(xué)。

梁運姍，王 智