王盼盼，常文輝，駱文靜，陳景元，杜可軍（.第四軍醫(yī)大學(xué)勞動(dòng)與環(huán)境衛(wèi)生教研室，陜西西安7002；2.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)系，陜西西安7002；.陜西省疾病預(yù)防控制中心，西安70054）

氯化鎳對(duì)真核小鼠胚胎成纖維細(xì)胞超氧化物歧化酶2的影響及其機(jī)制

王盼盼1，2，常文輝3，駱文靜1，陳景元1，杜可軍1
（1.第四軍醫(yī)大學(xué)勞動(dòng)與環(huán)境衛(wèi)生教研室，陜西西安710032；2.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)系，陜西西安710032；3.陜西省疾病預(yù)防控制中心，西安710054）

目的在真核小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）內(nèi)，進(jìn)行不同濃度或不同時(shí)間的氯化鎳（NiCl2）刺激，觀察超氧化物歧化酶2（SOD2）的變化，對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行探討。方法培養(yǎng)MEF系，制備N(xiāo)iCl2溶液進(jìn)行處理，利用Western blotting觀察不同濃度或不同時(shí)間的NiCl2刺激后SOD2的變化。隨后判斷其可能的機(jī)制。結(jié)果不同濃度的NiCl2刺激MEF 12 h后，SOD2的表達(dá)總體上有下降趨勢(shì)，磷酸化蛋白激酶B的表達(dá)總體上有上升趨勢(shì)，而磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子（p-Stat3）的表達(dá)總體上有下降趨勢(shì)；相同濃度的NiCl2刺激MEF不同時(shí)間后，SOD2和p-Stat3的表達(dá)總體上有下降趨勢(shì)；p-Stat3與SOD2的總體變化趨勢(shì)一致。結(jié)論SOD2在受到NiCl2的刺激作用后，總體上呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；p-Stat3可能是作為轉(zhuǎn)錄因子，在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行了SOD2的調(diào)控。

鎳； 超氧化物歧化酶； 成纖維細(xì)胞； 基因表達(dá)； 氯化鎳

鎳作為一種重要的有色金屬，廣泛存在于多種合金中，被稱為“工業(yè)維生素”。鎳是不銹鋼主要合金原料[1]。全球不銹鋼產(chǎn)量的迅速增加，直接刺激了鎳需求的急速上升。進(jìn)入21世紀(jì)，中國(guó)不銹鋼的產(chǎn)量達(dá)到世界首位，牽動(dòng)全球不銹鋼總產(chǎn)量的走勢(shì)。目前，國(guó)內(nèi)直接接觸鎳及其化合物的作業(yè)人員數(shù)量很多[2]。對(duì)環(huán)境而言，鎳是一種潛在的危害物。環(huán)境中鎳污染的最大來(lái)源是人為活動(dòng)，包括鎳礦及其他重金屬礦的開(kāi)采、冶煉、粉末冶金及相關(guān)企業(yè)的“三廢（廢水、廢氣和廢渣）”，化學(xué)試劑及其他含鎳制品的生產(chǎn)和使用等。鎳毒性給人類(lèi)的健康帶來(lái)了極大痛苦和損失，國(guó)際癌癥研究中心已經(jīng)將鎳化合物定義為人類(lèi)致癌物，所以加大對(duì)鎳及其相關(guān)毒性的防治研究具有重要現(xiàn)實(shí)意義。本研究在真核小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）內(nèi)進(jìn)行不同濃度或不同時(shí)間的氯化鎳（NiCl2）刺激，觀察超氧化物歧化酶2（SOD2）的變化，對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 特異性抗體[磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子（p-Stat3，Tyr-705）、p-Stat3（Ser-727）、Stat3、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt，Thr-308）、p-Akt（Ser-473）、Akt]購(gòu)置于美國(guó)Cell Signaling，Beverly，MA公司。特異性抗體SOD2購(gòu)置于美國(guó)Epitomics，Burlingame，CA公司。特異性抗體肌動(dòng)蛋白β（β-actin）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）購(gòu)置于美國(guó)Sigma，St.Louis，MO公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MEF的培養(yǎng)主要采用方法參照文獻(xiàn)[3]。具體如下：培養(yǎng)采用DMEM培養(yǎng)液加10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和2 mmol/L谷氨酰胺（CA），37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下孵箱培養(yǎng)。待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞處理 制備N(xiāo)iCl2溶液，在6孔板中采用2 mmol/L的終濃度 NiCl2分別對(duì) MEF進(jìn)行 0、3、6、9、12、24 h處理；同時(shí)采用0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L終濃度NiCl2分別對(duì)MEF進(jìn)行12 h處理。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）處理

1.2.3.1 細(xì)胞放置在6孔培養(yǎng)板里進(jìn)行培養(yǎng)，生長(zhǎng)密度達(dá)到培養(yǎng)孔面積的85%時(shí)收集細(xì)胞。收集細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)板置于冰上。細(xì)胞首先用4℃的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，然后用裂解液進(jìn)行處理。裂解液的組成包括10mmol/LTris-HCl、pH=7.4的 1%十二烷基硫酸鈉、1 mmol/L Na3VO4及蛋白酶抑制劑，細(xì)胞蛋白的提取物參照文獻(xiàn)[2]的方法進(jìn)行處理，先用超聲波進(jìn)行處理，接下來(lái)置于100℃下5min進(jìn)行蛋白變性，用于蛋白電泳。

1.2.3.2 Western blotting檢測(cè)[4]。裂解后的細(xì)胞進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)。蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)置于美國(guó)Bio-Rad Lab oratories，Hercules，CA公司。對(duì)等量的細(xì)胞裂解蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電脈（SDS-PAGE）。接下來(lái)蛋白被轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，PVDF膜來(lái)源于美國(guó)Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA公司。轉(zhuǎn)膜之后封閉，接下來(lái)分別加入一抗，進(jìn)行p-Stat3（Tyr-705）、p-Stat3（Ser-727）、Stat3、p-Akt（Thr-308）、p-Akt（Ser-473）、Akt、SOD2、β-actin、GAPDH等檢測(cè)；采用堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度NiCl2作用于MEF 12 h后SOD2及p-Akt表達(dá)變化 不同濃度的NiCl2（0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L）作用于MEF 12 h后，可觀察到SOD2蛋白的表達(dá)總體上有下降趨勢(shì)。同樣的NiCl2作用條件下，可以觀察到p-Akt蛋白表達(dá)無(wú)論是在Ser-473位點(diǎn)，還是在Thr-308位點(diǎn)，總體上都有增高趨勢(shì)。與此同時(shí)，可以觀察到在不同濃度的NiCl2作用于MEF 12 h后，總Akt蛋白表達(dá)量總體上無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度NiCl2作用于MEF12h后SOD2及p-Akt表達(dá)變化

2.2 不同濃度NiCl2作用于MEF 12 h后p-Stat3表達(dá)變化 不同濃度的NiCl2（0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L）作用于MEF細(xì)胞12 h后，可以觀察到p-Stat3蛋白的表達(dá)總體上有下降趨勢(shì)?？梢杂^察到p-Stat3蛋白表達(dá)無(wú)論是在Ser-727位點(diǎn)，還是在Tyr-705位點(diǎn)，總體上都有降低趨勢(shì)。與此同時(shí)，可以觀察到在不同濃度的NiCl2作用于MEF細(xì)胞12 h后，Stat3蛋白的表達(dá)量總體上無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度NiCl2作用于MEF 12 h后p-Stat3表達(dá)變化

2.3 相同濃度NiCl2作用于MEF不同時(shí)間SOD2及p-Stat3表達(dá)變化 相同濃度的Nicl2（2 mmol/L）作用于MEF 0、3、6、9、12、24 h后，可以觀察到SOD2及p-Stat3蛋白的表達(dá)總體上有下降趨勢(shì)，而且可以觀察到p-Stat3蛋白表達(dá)無(wú)論是在Ser-727位點(diǎn)，還是在Tyr-705位點(diǎn)，總體上都有降低趨勢(shì)。與此同時(shí)，可以觀察到在相同濃度的NiCl2作用于MEF不同時(shí)間后，Stat3蛋白的表達(dá)量總體上無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖3。

圖3 相同濃度NiCl2作用于MEF不同時(shí)間p-Stat3表達(dá)變化

3 討 論

作為一種重要的有色金屬，鎳及其化合物在工業(yè)生產(chǎn)中有廣泛應(yīng)用。但同時(shí)鎳化合物又被確定為人類(lèi)致癌物。對(duì)鎳化合物中毒機(jī)制的研究，有利于工業(yè)生產(chǎn)開(kāi)展針對(duì)性的職業(yè)安全防護(hù)。研究表明，鎳化合物可以誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)產(chǎn)生超氧陰離子自由基損傷細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生明顯的氧化損傷，繼而導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)各種損傷，甚至引起細(xì)胞發(fā)生突變、腫瘤發(fā)生等[1]。

機(jī)體有一套完整的抗氧化體系，能防止自由基帶來(lái)的氧化損傷，其中SOD[5]是以超氧陰離子自由基為底物的金屬蛋白酶，其可將自由基催化為過(guò)氧化物，再在谷胱甘肽過(guò)氧化物酶或過(guò)氧化氫酶的催化下成為水。SOD作為體內(nèi)最主要的抗氧化物酶，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其活力可間接反映機(jī)體抗氧化損傷和清除自由基的能力。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)SOD有3種[6]，包括SOD1，又名Cu-Zn SOD，主要存在于真核生物細(xì)胞質(zhì)中；SOD2，又名Mn-SOD，在真核生物及原核生物的線粒體中普遍存在；SOD3，又名Fe-SOD，主要存在于原核生物中。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，SOD2可能作為一種新的腫瘤抑制劑而發(fā)揮作用[7]。研究表明，SOD2的活性在超過(guò)80種的腫瘤細(xì)胞中有所下降[8]。過(guò)表達(dá)的SOD2將會(huì)導(dǎo)致部分腫瘤細(xì)胞的抑制[8]，SOD2可能與部分腫瘤受到抑制有關(guān)[9]。因此，研究SOD2的分子調(diào)控機(jī)制在腫瘤學(xué)及相關(guān)研究領(lǐng)域具有非常重要的意義。本研究結(jié)果表明，不同濃度NiCl2作用相同時(shí)間或相同濃度NiCl2作用不同時(shí)間，都能導(dǎo)致SOD2有一定程度下降。本研究結(jié)果也表明，導(dǎo)致SOD2下降的同時(shí)，可以引起p-Akt表達(dá)量的增高。提示p-Akt可能與SOD2的負(fù)調(diào)控有關(guān)。這些與Du等[10]研究結(jié)果是一致的。

Akt又稱蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。Akt在細(xì)胞的存活和凋亡中起重要作用。多種因子包括胰島素等生長(zhǎng)和存活因子都能激活A(yù)kt信號(hào)途徑。有研究表明，Akt分子通過(guò)對(duì)FoxO3a等分子的調(diào)控，主要是調(diào)節(jié)Ser-253和Ser-315等位點(diǎn)的磷酸化[11]。Ser-253等位點(diǎn)的磷酸化FoxO3a導(dǎo)致蛋白核定位的改變，最終導(dǎo)致其與調(diào)控基因的啟動(dòng)子進(jìn)行結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的基因的調(diào)控[12]。

研究表明，鎳對(duì)SOD的下調(diào)可能在蛋白或基因水平都有體現(xiàn)[1]，提示這種調(diào)控作用有可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。許多轉(zhuǎn)錄因子包括特異性蛋白1（SP1）、激活蛋白1（AP1）、Stats等分子，都在一定程度上參與了SOD2分子的調(diào)控[13-14]。本研究結(jié)果證明，不同濃度的NiCl2作用于MEF 12 h后或相同濃度的NiCl2作用于MEF不同時(shí)間后，SP1、AP1的變化趨勢(shì)同SOD2的變化并不一致（圖片未附），提示在現(xiàn)有作用條件下，SP1和AP1可能并未參與對(duì)SOD2在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。而p-Stat3蛋白，無(wú)論是在Ser-727位點(diǎn)，還是在Tyr-705位點(diǎn)，表達(dá)量總體上都有降低趨勢(shì)。這些變化趨勢(shì)，都同SOD2的總體變化趨勢(shì)基本一致。提示p-Stat3有可能作為轉(zhuǎn)錄因子在NiCl2誘導(dǎo)SOD2表達(dá)下降的過(guò)程中發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，在NiCl2作用于MEF后，能夠引起MEF內(nèi)的SOD2表達(dá)水平下降，這種下降可能是受到Akt的負(fù)調(diào)控，并且可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，Stat3有可能作為一種轉(zhuǎn)錄因子在其中起到一種調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)了NiCl2對(duì)SOD2的調(diào)控可能是通過(guò)p-Stat3進(jìn)行調(diào)控，并且這種調(diào)控可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。本研究為SOD2的進(jìn)一步探索打下了基礎(chǔ)，但更為直接的證據(jù)呈現(xiàn)尚有待于進(jìn)行Stat3與SOD2的免疫共沉淀等研究。

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Effect with NiCl2 on SOD2 in MEF eukaryotic cells and its mechanisms

Wang Panpan1，2，Chang Wenhui3，Luo Wenjing1，Chen Jingyuan1，Du Kejun1
（1.Department of Occupational and Environmental Health，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi′an，Shaanxi 710032，China；2.Department of Oral Medicine，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi′an，Shaanxi 710032，China；3.Shaanxi Center for Disease Control and Prevention，Xi′an 710054，China）

ObjectiveIn MEF eukaryotic cells，it was stimulated with NiCl2with different concentrations and times.It is investigated the change of SOD2 and its potential mechanisms.MethodsCultivating MEF cells line and preparing Nicl2 solutions，it was observed the change of SOD2 stimulated by NiCl2of different concentrations and times by Western blotting and then judged the potential mechanism.ResultsAfter stimulating MEF for continuous 12 hours with different-concentration NiCl2，the expression of SOD2 was orientated to declining and p-Stat3 and p-Akt rising respectively in general.After stimulating MEF for different time period with the same-concentration NiCl2，the expressions of SOD2 and p-Stat3 were both orientated to decline and rising respectively generally.The overall change of SOD2 and p-Stat3 were in consistent.ConclusionStimulated by NiCl2，SOD2 showed a trend of decline，p-Stat3，probably as the transcription factor，adjusted SOD2 on the transcriptional level.

Nickel； Superoxide dismutase； Fibroblasts； Gene expression； Nickel chloride

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.06.008

：A

：1009-5519（2015）06-0820-03

2014-10-12）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30972429）；教育部長(zhǎng)江學(xué)者創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目（PCSIRT1112）；中國(guó)博士后課題資助項(xiàng)目（20060391015）。

王盼盼（1992-）,男，陜西西安人，主要從事環(huán)境分子毒理學(xué)研究；E-mail：cd_novo@hotmail.com。

杜可軍（E-mail：dukejun@fmmu.edu.cn）。