譚嘉鑫，游 逾，曾林立，賴潔娟，張玉君，別 平，白蓮花

（第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院肝膽外科，重慶400030）

口服二乙基亞硝胺誘導(dǎo)建立同系小鼠肝硬化模型

譚嘉鑫，游 逾，曾林立，賴潔娟，張玉君，別 平，白蓮花

（第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院肝膽外科，重慶400030）

目的 嘗試采用二乙基亞硝胺（DEN）喂飼小鼠成功誘導(dǎo)和建立小鼠肝硬化模型。方法 選取純系C57BL/6小鼠60只，隨機(jī)分為實驗組和對照組，各30只。實驗組小鼠喂飼含DEN的飲水誘發(fā)肝硬化，對照組小鼠喂飼蒸餾水。采用HE染色、Masson染色等方法觀察兩組小鼠肝臟組織形態(tài)、纖維化，并連續(xù)30 d監(jiān)測兩組小鼠體質(zhì)量變化，用行為學(xué)方法觀察兩組小鼠的自主運動差異判斷其精神狀態(tài)變化。結(jié)果 隨著喂飼DEN時間的增加，HE染色和Masson染色均顯示實驗組小鼠肝臟纖維化組織增生，肝硬化程度逐漸加重，各時間點的半定量評分系統(tǒng)評分與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗組小鼠的體質(zhì)量隨著DEN喂飼時間的增加而明顯降低，而對照組小鼠的體質(zhì)量卻略有增加，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗組小鼠的運動總路程少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 DEN喂飼可誘發(fā)C57BL/6小鼠逐漸從肝纖維化到肝硬化，最終成功建立了前所未有的可作為研究人類肝硬化的一種理想動物模型。

二乙基亞硝胺； 肝硬化/病理學(xué)； 小鼠； 模型； 誘導(dǎo)

肝硬化是臨床常見慢性進(jìn)行性肝病，常由肝纖維化演變而來，最終發(fā)展為肝癌，嚴(yán)重危害人類健康。初期增生的肝臟纖維組織形成小的條索，尚未互相連接形成纖維間隔而改建肝小葉結(jié)構(gòu)時，為肝纖維化。其實質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成率大于降解率，在肝臟內(nèi)過度沉積的病理學(xué)改變，加重之后發(fā)展為肝硬化。隨著研究不斷深入，學(xué)者對肝硬化的發(fā)病機(jī)制有了更加深入的認(rèn)識，并提出肝纖維化甚至肝硬化可能逆轉(zhuǎn)的觀點[1-2]。因此，建立肝硬化動物模型是肝硬化研究的必要條件。目前，研究肝硬化的同系動物模型缺乏。本研究采用喂飼二乙基亞硝胺（DEN）建立小鼠肝硬化模型，旨在探討該方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 純系C57BL/6小鼠60只，雌性和雄性各30只；8～10周齡；體質(zhì)量為20～22 g。均購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物實驗中心，購回后無特定病原體級適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d。DEN購自美國sigma公司。

1.2 方法 將60只小鼠隨機(jī)分為實驗組和對照組，各30只。將0.14 mL DEN溶于1 000 mL滅菌水（濃度為133 μg/mL），配成 DEN溶液。實驗組小鼠連續(xù)喂飼6d DEN溶液，然后喂飼1 d蒸餾水，如此循環(huán)。對照組小鼠僅喂飼蒸餾水。分別于飼喂第4、6、8、10、12周脫頸處死實驗組和對照組小鼠，每組每次6只，采集肝臟標(biāo)本。取肝左葉，迅速置于10%甲醛溶液固定3 d，脫水，透明，浸蠟，包埋，切片。行HE染色與Masson染色檢測。采用Chevallier等[3]的半定量評分系統(tǒng)（SSS）對小鼠肝纖維化程度進(jìn)行評分。造模第1～30天，每天定時測量小鼠體質(zhì)量。造模第8周時，在實驗組和對照組中各隨機(jī)選取6只小鼠進(jìn)行曠場實驗，利用曠場設(shè)備觀察記錄分析小鼠的自發(fā)性活動、應(yīng)激及探索習(xí)性。實驗開始前2 d，將小鼠置入行為實驗室適應(yīng)整體環(huán)境。正式實驗時，將小鼠置于大小為25 cm×25 cm×32 cm的插板式實驗場中，任其自由活動10 min，嚴(yán)格避免聲音和光線刺激。曠場設(shè)備攝像頭追蹤記錄小鼠運動軌跡，利用其軟件分析小鼠運動總路程。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠肝組織病理學(xué)檢查情況 在第11周時實驗組死亡1例小鼠。對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，肝竇正常，未見異常肝細(xì)胞及纖維組織增生。實驗組小鼠第4周肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，少量纖維組織增生；第6周肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，纖維組織輕度增生；第8周肝小葉中央靜脈增厚，纖維組織明顯增生；第10、12周肝臟大量纖維組織增生，假小葉出現(xiàn)，肝硬化形成。見圖1、2。

圖1 兩組小鼠肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE染色，200×）

2.2 兩組小鼠SSS分?jǐn)?shù)比較 實驗組小鼠第4、6、8、10、12周SSS分?jǐn)?shù)分別為（1.17±0.41）、（3.83±1.47）、（12.16± 1.72）、（18.50±1.87）、（22.33±0.81）分；對照組小鼠分別為（0.40±0.17）、（0.40±0.17）、（0.51±0.33）、（0.51±0.33）分、（0.51±0.33）分。兩組小鼠第4、6、8、10、12周SSS分?jǐn)?shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.254、5.688、16.316、23.212、62.549，P＜0.05）。

圖2 兩組小鼠肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果（Masson染色，200×）

2.3 兩組小鼠體質(zhì)量變化情況比較 對照組小鼠第1～30天體質(zhì)量隨喂飼時間延長逐漸增加，實驗組小鼠體質(zhì)量逐漸下降，兩組體質(zhì)量變化呈線性趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 兩組小鼠第1～30天體質(zhì)量變化

2.4 兩組小鼠曠場實驗情況比較 對照組小鼠運動總路程為（20 140±2 156）mm，顯著多于實驗組小鼠的（16 384±2 738）mm，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 2.64，P＜0.05）。

3 討 論

肝細(xì)胞受損后，會引起肝細(xì)胞的壞死、再生、發(fā)生局灶性肝纖維化，進(jìn)而發(fā)生肝硬化[4]。在中國，乙型肝炎病毒感染為肝硬化的主要起因[5-6]。肝臟損傷持續(xù)存在，組織發(fā)生修復(fù)反應(yīng)時因細(xì)胞外基質(zhì)合成速度大于降解速度，引起纖維結(jié)締組織增生，稱為肝纖維化，當(dāng)其進(jìn)一步發(fā)展引起肝小葉改建，有假小葉及結(jié)節(jié)形成時則稱為肝硬化，最后演變?yōu)楦伟7-8]。肝硬化為肝癌的前置病變。為早期防治肝硬化提供理想的動物模型具有重要意義。

目前，制備肝硬化模型的方法較多，應(yīng)用較為廣泛的動物模型有化學(xué)性肝硬化、營養(yǎng)性硬化、酒精性肝硬化、免疫性肝硬化、膽總管結(jié)扎致肝硬化、血吸蟲性肝硬化等。每種造模方法致病因素不同，誘導(dǎo)肝硬化的機(jī)制、穩(wěn)定性、重復(fù)性也不同。文獻(xiàn)中對小鼠誘發(fā)性肝硬化模型報道較少，雖有報道用四氯化碳（CC14）和乙醇能誘發(fā)小鼠肝硬化[9-10]，但成功率不高，卻在誘發(fā)過程中小鼠死亡率很高；也有報道用CC14腹腔注射的方法誘導(dǎo)小鼠肝硬化[11]。有報道稱，單純應(yīng)用DEN在12～15周能成功誘發(fā)大鼠肝硬化[12-13]，但此方法未見在小鼠中報道。因此，本實驗應(yīng)用DEN對C57BL/6同系小鼠進(jìn)行肝硬化誘發(fā)，得到了理想的小鼠肝硬化模型。

DEN具有較強(qiáng)的肝臟化學(xué)毒性，其所含的亞硝胺基團(tuán)具有中毒劑和誘癌劑的雙重作用[14]，DEN誘發(fā)的腫瘤多為肝細(xì)胞癌，與人類肝細(xì)胞癌較為相似[15]。Sato等[16]研究表明，DEN是一種很強(qiáng)的化學(xué)致癌劑，且對肝臟有明顯的親和性。本實驗在用DEN誘導(dǎo)建模后，從形態(tài)學(xué)等方面進(jìn)行了模型的驗證，經(jīng)Masson三色染色證實實驗組小鼠肝組織中央靜脈及匯管區(qū)周圍膠原纖維隨時間變化明顯增生。在后期肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞空泡樣變性，小葉間隔形成。

綜上所述，本實驗成功采用單劑量DEN短時期喂飼的方法建立同系小鼠肝硬化模型，具有死亡率低（小于10%）、操作方便、費用低廉、誘導(dǎo)周期短、重復(fù)性好、肝硬化率較高等特點，與人類肝硬化發(fā)病特點相似，拓展了小鼠肝硬化模型的構(gòu)建方式，是一種成功的小鼠肝硬化模型。

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Oral DEN induction in establishment of liver cirrhosis in homologous mice

Tan Jiaxin，You Yu，Zeng Linli，Lai Jiejuan，Zhang Yujun，Bie Ping，Bai Lianhua
（Department of Hepatobiliary Surgery，Southwest Hospital of Third Millitary Medical University，Chongqing 400030，China）

ObjectiveTo attempt oral DEN to induce and establish hepatic cirrhosis model in C57BL/6 mice.MethodsA total of 60 C57BL/6 mice were randomly divided into the experimental group and the control group，30 of each group.The mice in the experimental group were fed with water contaning DEN while the control group with distilled water.The liver morphological structure and fibrillation of the two groups were observed by HE and Masson dyeing.The body weight variation of mice in the two groups was measured in consecutive 30 days.The difference in autokinetic movement between the two groups was investigated by behavioral approach to judge their mental state changes.ResultsIt showed with the longer DEN was given，the heavier the fibrosis tissue hyperplasia and hepatic cirrhosis degree displayed by HE and Masson dyeing.The semi-quantitative scoring system scoring at different time points in the experimental group had no statistical significance compared with that of the control group（P＜0.05）.The body weight declined obviously with increasing of feeding time in the experimental group while the mice in the control group slightly increased.There were statistical significance in difference（P＜0.05）.The behavioristics results showed that the total movement distance of the experimental mice was weaker than that of the normal mice，whose difference had statistical significance（P＜0.05）.ConclusionDEN-induced hepatic cirrhosis model in C57BL/6 mice is successfully established from hepatic fibrosis，and it can be used as an ideal animal model for the study of human hepatic cirrhosis.

Diethylnitrosamine； Liver cirrhosis/pathology； Mouse； Model； Guide

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.06.005

：A

：1009-5519（2015）06-0812-03

2015-01-30）

國家自然科學(xué)基金資助項目（81170425）。

譚嘉鑫（1984-），男，重慶沙坪壩人，主要從事肝膽外科臨床工作；E-mail：330406265@qq.com。

白蓮花（E-mail：qqg63@outlook.com）。