劉觀成，何曉松，宣廣旭，王文華，陳文文

（1.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林541004；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科，廣西桂林541001）

腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物在鼻咽癌細(xì)胞株中的表達(dá)

劉觀成1，何曉松2，宣廣旭2，王文華2，陳文文1

（1.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林541004；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科，廣西桂林541001）

目的探索腫瘤干細(xì)胞（CSC）標(biāo)志物ABCG2、CD44、CD34在鼻咽癌細(xì)胞株CNE2、5-8F和6-10B中的表達(dá)情況，為選擇CSC標(biāo)志物進(jìn)行鼻咽癌CSC樣研究奠定基礎(chǔ)。方法常規(guī)培養(yǎng)CNE2、5-8F和6-10B這3種鼻咽癌細(xì)胞株，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)3種鼻咽癌細(xì)胞株中ABCG2、CD44、CD34細(xì)胞比例及其交互情況。結(jié)果ABCG2在CNE2、5-8F和6-10B這3種鼻咽癌細(xì)胞株中表達(dá)率分別為0.1%、18.6%、19.9%；CD44在CNE2、5-8F和6-10B中表達(dá)率分別為99.5%、93.2%、99.1%；CD34在CNE2、5-8F和6-10B中表達(dá)率分別為0、3.0%、0.1%。在5-8F中，ABCG2+CD44+細(xì)胞交互比例為11.6%，ABCG2+CD34+細(xì)胞交互比例為0。結(jié)論5-8F和6-10B中CD34+細(xì)胞比例與CSC理論中CSC的比例相符。CD34可以作為鼻咽癌CSC的候選標(biāo)志物。

腫瘤干細(xì)胞； 生物學(xué)標(biāo)記； 鼻咽腫瘤/病理學(xué)； 細(xì)胞系； 表達(dá)； 交互作用

鼻咽癌（NPC）是我國(guó)南方常見十大惡性腫瘤之一，每年新增患者數(shù)達(dá)10萬(wàn)例以上，居世界首位。因此，鼻咽癌是中國(guó)南方最嚴(yán)重的健康問題之一。在臨床治療中通常以放療為主并輔以適當(dāng)化療，遠(yuǎn)期預(yù)后仍然不良，約55%NPC在治療后5年出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[1]。無(wú)論是放療或化療，都不可避免地給患者帶來(lái)極大痛苦及不良反應(yīng)，并且目前的治療手段已無(wú)法大幅度提高患者5年存活率，缺乏對(duì)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的有效控制及復(fù)發(fā)后耐藥性增加是造成這一現(xiàn)象的主要原因。因此，探索防治鼻咽癌的新技術(shù)、新方法是十分緊迫的任務(wù)。腫瘤干細(xì)胞（CSC）理論認(rèn)為，腫瘤組織中存在一群或多群具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群，即CSC[2-3]。進(jìn)而認(rèn)為腫瘤是一種干細(xì)胞疾病，這部分細(xì)胞具有無(wú)限的自我更新及分化潛能；高成瘤性及耐藥性是其顯著的特性。目前的一些研究認(rèn)為，這些細(xì)胞比率很低，但相對(duì)于腫瘤中的其他細(xì)胞卻表現(xiàn)出更加突出的增殖、分化和侵襲能力，而且明顯地耐受輻射及化學(xué)治療。對(duì)CSC特性的深入研究，被認(rèn)為是尋找到克服腫瘤方法的新希望。鼻咽癌CSC研究也逐漸開展，但尚未找到鼻咽癌CSC特征性標(biāo)記。本研究通過(guò)探索CSC標(biāo)志物ABCG2、CD44、CD34在鼻咽癌細(xì)胞株中表達(dá)情況，為分離研究鼻咽癌CSC樣細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人NPC細(xì)胞株CNE2、5-8F、6-10B由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）、青/鏈霉素、二甲基亞砜（DMSO，Gibco公司），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），anti-CD34-PE（天津三箭生物技術(shù)有限公司），anti-CD44-PE、anti-ABCG2-FITC及其同型（Biolegend公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 分別將鼻咽癌細(xì)胞株CNE2、5-8F、6-10B培養(yǎng)在含10%新生牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37℃飽和溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到鋪滿培養(yǎng)瓶底80%時(shí)行傳代培養(yǎng)：先用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，加胰蛋白酶5 mL進(jìn)行消化，約1 min后加入6 mL含血清的完全培養(yǎng)基終止消化，以1 000 r/min離心5 min，去上清液，加全培養(yǎng)基按1∶2或1∶3傳代培養(yǎng)。

1.2.2 流式細(xì)胞儀分選 細(xì)胞計(jì)數(shù)約1×106，用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化，PBS洗滌，離心（1 000 r/min）5 min，去上清液，用100 μL PBS重新懸浮，每種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)置7個(gè)檢測(cè)上樣管，分別加入PBS、anti-ABCG2-FITC同型、anti-ABCG2-FITC、anti-CD44-PE同型、anti-CD44-PE、anti-CD34-PE同型、anti-CD34-PE，4℃避光孵育60 min，離心（1 000 r/min）5 min，去上清液，PBS洗滌至少2次，200目細(xì)胞網(wǎng)篩過(guò)濾，加200 μL PBS重新懸浮細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 雙陽(yáng)性細(xì)胞的檢測(cè) 對(duì)3種CSC標(biāo)志物均有表達(dá)的細(xì)胞再次設(shè)置5個(gè)檢測(cè)上樣管，分別加入PBS、anti-ABCG2-FITC同型和 anti-CD44-PE同型、anti-ABCG2-FITC和 anti-CD44-PE、anti-ABCG2-FITC同型和 anti-CD34-PE同型、anti-ABCG2-FITC和anti-CD34-PE，4℃避光孵育60 min，離心（1 000 r/min）5 min，去上清液，PBS洗滌至少2次，200目細(xì)胞網(wǎng)篩過(guò)濾，加200 μL PBS重新懸浮細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，ABCG2在CNE2、5-8F和6-10B這 3種鼻咽癌細(xì)胞株中表達(dá)率分別為 0.1%、18.6%、19.9%；CD44在CNE2、5-8F和6-10B中表達(dá)率分別為99.5%、93.2%、99.1%；CD34在CNE2、5-8F和6-10B中表達(dá)率分別為0、3.0%、0.1%；在5-8F中，ABCG2+CD44+細(xì)胞交互比例為11.6%，ABCG2+CD34+細(xì)胞交互比例為0。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CSC標(biāo)志物在鼻咽癌細(xì)胞株中的表達(dá)

3 討 論

CSC理論認(rèn)為，CSC是腫瘤起源細(xì)胞，是腫瘤組織的一個(gè)亞群，占腫瘤細(xì)胞極少數(shù)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥、對(duì)放療的抵抗以及復(fù)發(fā)中起著至關(guān)重要作用。CSC具有其特有的生物學(xué)特性，主要如下：（1）具有腫瘤細(xì)胞再生能力并促成腫瘤的異質(zhì)性[4-5]；（2）具有多重耐藥性和對(duì)射線抗性[6-7]；（3）具有很強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力[8]；（4）擁有與CSC相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路[9]；（5）表達(dá)與正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和CSC相關(guān)分子標(biāo)志，如CD133是一種細(xì)胞膜表面蛋白，表達(dá)于正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和CSC，可作為某些CSC的特征性表面標(biāo)志，利用其結(jié)合流式細(xì)胞儀等技術(shù)可以分選出特異性CSC[10]。

獲取CSC是進(jìn)行CSC研究的前提。CSC的分選主要基于CSC生物特性。常用方法如下：（1）根據(jù)CSC特征性表面標(biāo)記，CSC表達(dá)的特征性表面標(biāo)記，是區(qū)分CSC和非CSC最準(zhǔn)確的標(biāo)志。利用CSC特征性表面標(biāo)記結(jié)合免疫磁珠、流式細(xì)胞儀等技術(shù)，可以分離出高純度CSC；（2）根據(jù)CSC離體培養(yǎng)特性；（3）根據(jù)側(cè)群細(xì)胞特性；（4）利用（LRC）技術(shù)。

ABCG2基因編碼多耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所以又稱為多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MDRP）基因。該蛋白可以將細(xì)胞內(nèi)藥物或有害代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，從而維持細(xì)胞正常功能，在惡性腫瘤的多藥耐藥方面起重要作用[11]。而多耐藥性是CSC的一個(gè)重要特性，在放化療抵抗中起著重要作用，因此其可能是CSC重要標(biāo)記物。在一些實(shí)體腫瘤中，ABCG2+腫瘤細(xì)胞不僅耐放化療，而且具有很強(qiáng)的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力，這與CSC的特性相似。

CD44是黏附因子家族中一員，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間黏附作用的膜表面糖蛋白，參與細(xì)胞的增殖、分化、黏附、遷移等過(guò)程，CD44分子還可作為多種實(shí)體CSC的表面標(biāo)志。

人CD34基因定位于clql2-qter上，與CIM5及一些膜蛋白家族成員相毗鄰。CD34 cDNA長(zhǎng)2.7 kb，由1個(gè)長(zhǎng)的開放閱讀框構(gòu)成，編碼373氨基酸殘基多肽鏈。CD34基因產(chǎn)物CD34抗原為一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為105×103～120×103的跨膜細(xì)胞表面糖蛋白。在急性髓細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病患者中確定CSC的第1個(gè)篩選標(biāo)志就是CD34分子。Fiegel等[12]通過(guò)免疫組織化學(xué)證實(shí)，人兒童肝母細(xì)胞瘤中的CSC樣特征性表面標(biāo)記是CD34+THY1+C-kit+。劉丹等[13]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌的CSC標(biāo)志物為CD133+、CD34+、CD44+。

目前，鼻咽癌CSC研究取得初步進(jìn)展[14]，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種CSC表面標(biāo)志物及干性基因在鼻咽癌中表達(dá)并分選出一些細(xì)胞亞群，這些亞群雖有CSC的一些特性，但仍不是鼻咽癌CSC。因?yàn)闄z驗(yàn)CSC的“金標(biāo)準(zhǔn)”為裸鼠體內(nèi)成瘤能力，目前鼻咽癌CSC裸鼠體內(nèi)的成瘤能力最強(qiáng)的為Wang等[15]分離的ABCG2+細(xì)胞，用2×103ABCG2+鼻咽癌細(xì)胞便可成瘤，較未分離鼻咽癌細(xì)胞成瘤能力強(qiáng)50倍，但這些與白血病CSC、乳腺癌CSC 100個(gè)就能成瘤相差甚遠(yuǎn)。因此，尋找鼻咽癌CSC特異性表面標(biāo)記物，探索有效分離、鑒定鼻咽癌CSC方法是目前鼻咽癌CSC研究的迫切任務(wù)之一。

本研究結(jié)果顯示，不同CSC標(biāo)志物在不同鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)有差異，這可能由不同標(biāo)志物的功能及細(xì)胞本身的特性所決定，如5-8F細(xì)胞比其他鼻咽癌細(xì)胞成瘤、侵襲、耐藥等能力均較強(qiáng)，因此耐藥基因ABCG2及血管生成基因CD34在5-8F中的表達(dá)較高?；蛟S這也正是目前鼻咽癌CSC的研究較集中于5-8F的原因之一。鼻咽癌種類較多，因此不同CSC標(biāo)志物在不同鼻咽癌中的表達(dá)是否不同及不同種鼻咽癌細(xì)胞是否擁有共同的標(biāo)志物是值得探究的問題。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD44在CNE2、5-8F和6-10B這3種鼻咽癌細(xì)胞株中普遍高表達(dá)，其結(jié)果與莊慧文[16]檢測(cè)的CD44在CNE2中高表達(dá)相符合。本研究ABCG2在5-8F和6-10B中等水平表達(dá)，在CNE2中低表達(dá)；CD34在CNE2、5-8F和6-10B中普遍低表達(dá)；在5-8F中，ABCG2與CD44之間存在交互作用，但ABCG2與CD34之間無(wú)交互作用。5-8F和6-10B中CD34+細(xì)胞比例與CSC理論中CSC的比例相符。CD34可以作為鼻咽癌CSC研究的候選標(biāo)志物。以往對(duì)鼻咽癌CD34基因的研究集中在探索該基因功能，而不是把CD34分子作為細(xì)胞表面標(biāo)志，從而分離研究鼻咽癌中CD34+亞群生物特性及其與普通鼻咽癌細(xì)胞之間有無(wú)差異。本研究為一前期實(shí)驗(yàn)，意在探索不同CSC標(biāo)記物在鼻咽癌不同細(xì)胞株中的表達(dá)情況以及流式細(xì)胞儀分選CSC樣細(xì)胞的可靠性，為后續(xù)鼻咽癌CSC研究奠定基礎(chǔ)，但尚未闡明鼻咽癌中CD34+亞群的生物特性及其與普通鼻咽癌細(xì)胞之間有無(wú)差異，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。

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The expression of cancer stem cell markers in human nasopharyngeal carcinoma cell lines

Liu Guancheng1，He Xiaosong2，Xuan Guangxu2，Wang Wenhua2，Chen Wenwen1
（1.Guilin Medical Hospital，Guilin，Guangxi 541004，China；2.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，the Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin，Guangxi 541001，China）

ObjectiveTo explore the expression of cancer stem cells（CSC）markers named ABCG2，CD44，CD34 in hu man nasopharyngeal carcinoma（NPC）CNE-2，5-8F and 6-10B cell lines to provide the basis of CSC markers research of NPC.MethodsThe NPC cell lines of CNE2，5-8F and 6-10B were cultivated regularly，of which，ABCG2，CD44，CD34 cell ratio was detected with flow cytometry.ResultsABCG2 positive cells accounted about 0.1%，18.6%and 19.9%in the CNE-2，5-8F，6-10B cell lines.CD44 positive cells accounted 99.5%，93.2%and 99.1%in the CNE-2，5-8F and 6-10B cell lines.CD34 positive cells accounted 0，3.0%and 0.1%in the CNE2，5-8F，and 6-10B cell lines.ABCG2+CD44+cell interation accounted about 11.6% and ABCG2+CD44+cell interation accounted about 0 in 5-8F cell lines.ConclusionThe expression proportion of CD34+in the 5-8F and 6-10B cell lines confirms to CSC markers of the CSC theory.CD34 may be deemed as a candidate marker of nasopharyngeal neoplas.

Neoplastic stem cells； Biological markers； Nasopharyngeal neoplasms/pathology； Cell line； Express； Interaction

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.06.001

A

1009-5519（2015）06-0801-03

2014-10-14）

劉觀成（1986-），男，安徽安慶人，在讀碩士研究生，主要從事頭頸腫瘤的研究；E-mail：362732615@qq.com。

何曉松（E-mail：hexiaosonggx@sina.com）。