楊 卓，于漢勛，李 巍

（1.大連市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 大連 116037；2.大連市畜牧總站，遼寧 大連 116037）

小反芻獸疫病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的研究

楊 卓1,2，于漢勛1,2，李 巍1,2

（1.大連市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 大連 116037；2.大連市畜牧總站，遼寧 大連 116037）

本試驗(yàn)利用濁度儀，采用實(shí)時(shí)濁度法進(jìn)行小反芻獸疫病毒RT-LAMP方法檢測(cè)。試驗(yàn)表明在65℃，50 m in內(nèi)即可完成對(duì)小反芻獸疫病毒的檢測(cè)。通過敏感性試驗(yàn)證明了該試驗(yàn)方法只能檢測(cè)目的病毒，而與同屬病毒無交叉反應(yīng)，靈敏性試驗(yàn)表明其靈敏度與Real-time RT-PCR方法相當(dāng)，臨床樣本試驗(yàn)表明其準(zhǔn)確性與RT-PCR檢測(cè)試劑盒相當(dāng)。

實(shí)時(shí)濁度法；小反芻獸疫病毒；檢測(cè)

小反芻獸疫（peste des petisruminants，PPR）是由小反芻獸疫病毒（peste des petisruminants virus，PPRV）引起的一種嚴(yán)重的烈性、接觸性傳染病。本病發(fā)病率可達(dá)100%，屬于OIE法定需報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國將其列入一類動(dòng)物疫病。從遺傳進(jìn)化系上，PPRV可分為4個(gè)譜系，譜系4分布最廣[1]。我國于2007年7～9月，在西藏首次爆發(fā)小反芻獸疫疫情[2]。目前，我國PPRV有兩種，分別為西藏株和新疆株。通過遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，新疆株亦屬于譜系4[3]。目前該病的主要檢測(cè)方法有通過血清學(xué)檢測(cè)抗體和病原的ELISA方法，以及檢測(cè)病毒核酸的普通PCR和RT-PCR方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（Loop-mediated isothermal ampl if ication，LAMP）是由Notomi等發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)具有快速、高效、高特異性和反應(yīng)條件簡單等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被應(yīng)用于多種疾病病原的檢測(cè)，如尼羅河病毒[4]、日本腦炎病毒[5]、裂谷熱病毒[6]、口蹄疫病毒[7]等。本文利用RT-LAMP技術(shù)和濁度儀，在65℃、擴(kuò)增1 h的條件下，對(duì)小反芻獸疫病毒核酸檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料 小反芻獸疫疫苗株（N75-1）、西藏分離株、新疆分離株和臨床樣本來自中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心（簡稱“流研中心”），小反芻獸疫疫苗株提取物來自新疆天康疫苗，犬瘟熱病毒來自遼寧省出入境檢驗(yàn)檢疫局。

1.2 試劑 小反芻獸疫RT-PCR檢測(cè)試劑盒，核酸提取試劑盒，核糖核酸擴(kuò)增試劑盒，LAMP反應(yīng)管。

1.3 儀器設(shè)備 濁度儀La-320C（日本榮研化學(xué)株式會(huì)社）；PCR反應(yīng)儀（AB公司7500）；分光光度計(jì)（NanoDrop ND-1000）。

1.4 核酸提取 所用病毒RNA核酸均按照核酸提取試劑盒說明進(jìn)行提取，分光光度計(jì)測(cè)定濃度，使用之前放-80℃保存。

1.5 反應(yīng)條件和方法 本試驗(yàn)按照核糖核酸擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)體系為25μL，其中FIP、BIP均為40 pmol；LF為20 pmol；F3、B3均為5 pmol；2×反應(yīng)緩沖液12.5μL；酶溶液1.0μL；去離子水4.5μL；RNA樣本2μL。最佳引物篩選反應(yīng)在65℃，90 min完成；特異性、敏感性和樣本檢測(cè)在65℃。

1.6 判定方法 RT-LAMP法和Real-time RT-PCR檢測(cè)小反芻獸疫病毒的判定方法如表1。

表1 RT-LAMP法和Rea l-time RT-PCR法判定標(biāo)準(zhǔn)Table1 Assessm ent standard for RT-LAMP and Real-time RT-PCR

1.7 RT-LAMP引物設(shè)計(jì)及最佳引物篩選 通過對(duì)小反芻獸疫病毒N基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定以GenBank中小反芻獸疫病毒序列號(hào)KM091959.1為模版參考序列。根據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)軟件（網(wǎng)址：http://primerexplorer.jp/e/）進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)，得到6組引物。通過最佳引物篩選試驗(yàn)，得出小反芻獸疫病毒RT-LAMP反應(yīng)的最佳引物。

1.8 特異性試驗(yàn) 將不同時(shí)間和不同地點(diǎn)分離出的小反芻獸疫病毒RNA樣本與同屬的犬瘟熱病毒RNA，按照如上體系進(jìn)行反應(yīng)，分析其特異性。

1.9 敏感性試驗(yàn) 分別用新疆天康小反芻獸疫病毒疫苗、西藏株病毒樣本、疫苗株（N75-1）樣本進(jìn)行核酸提取，測(cè)定濃度后進(jìn)行Real-time RT-PCR法和RT-LAMP法敏感性比較，分析兩種反應(yīng)對(duì)各類試驗(yàn)樣本的敏感性。

1.10 臨床樣本試驗(yàn) 以新疆天康小反芻獸疫病毒疫苗和流研中心保存的新疆株、西藏株、疫苗株（N75-1）等各類型小反芻獸疫病毒樣本為檢測(cè)對(duì)象，分析其在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。

2 結(jié)果

2.1 最佳引物篩選結(jié)果 以新疆天康小反芻獸疫病毒疫苗提取RNA，進(jìn)行小反芻獸疫RT-LAMP反應(yīng)的最佳引物篩選反應(yīng)模版。結(jié)果詳見圖1。

從結(jié)果看，6號(hào)引物在24 min時(shí)最先發(fā)生反應(yīng)，并出現(xiàn)特征性擴(kuò)增曲線，可判定6號(hào)引物為小反芻獸疫RT-LAMP反應(yīng)最佳引物。引物序列見表2。2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果 以不同地區(qū)和不同時(shí)間分離的小反芻獸疫病毒樣本和犬瘟熱病毒樣本進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2所示。說明，本研究設(shè)計(jì)的小反芻獸疫RT-LAMP檢測(cè)引物對(duì)各類小反芻獸疫病毒樣本均發(fā)生特異反應(yīng)，但不與其他同屬病毒發(fā)生反應(yīng)。從而證明了針對(duì)該引物建立的小反芻獸疫RT-LAMP反應(yīng)具有良好的特異性。

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)前，測(cè)定天康疫苗提取核酸（簡稱為T）濃度為2.3 ng/μL，疫苗株（N75-1）提取核酸（簡稱為Y）濃度為220 ng/μL，西藏株提取核酸（簡稱為X）濃度為89.2 ng/μL。分別將天康疫苗提取核酸進(jìn)行4個(gè)梯度的倍比稀釋；將疫苗株（N75-1）提取核酸進(jìn)行6個(gè)梯度的倍比稀釋；將西藏株提取核酸進(jìn)行6個(gè)梯度的倍比稀釋。同時(shí)用小反芻獸疫病毒檢測(cè)試劑盒進(jìn)行Real-time RT-PCR方法和本研究設(shè)計(jì)的RT-LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行比對(duì)。RTLAMP方法試驗(yàn)結(jié)果如圖3～5；RT-PCR方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6～8。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，小反芻獸疫RT-PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)天康疫苗的靈敏度為2.3×10-5ng/μL，對(duì)疫苗株（N75-1）的靈敏度為0.2201 ng/μL，對(duì)西藏株的靈敏度為0.0892 ng/μL。而本研究建立的RT-LAMP檢測(cè)方法對(duì)天康疫苗的靈敏度為2.3×10-5ng/μL，對(duì)疫苗株（N75-1）的靈敏度為0.2201 ng/μL，對(duì)西藏株的靈敏度為0.0892 ng/μL。RT-PCR與RT-LAMP兩者檢測(cè)敏感性一致。

2.4 臨床樣本試驗(yàn) 對(duì)10個(gè)臨床樣本使用RTLAMP方法和Real-time RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。其中Real-time RT-PCR方法用小反芻獸疫檢測(cè)試劑盒，試驗(yàn)結(jié)果如表3。從試驗(yàn)結(jié)果看，本研究建立的RT-LAMP檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性與RT-PCR結(jié)果一致。

圖1 小反芻獸疫RT-LAMP最佳引物篩選試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Resu lts of the screen assay for the best primers o f RT-LAMP注：CH1～CH6為6組備選引物（分別稱為1～6號(hào)引物），CH7為陰性，CH8為空白。

表2 小反芻獸疫RT-LAMP引物序列Tab le2 RT-LAMP primer sequences for PPRV

圖2 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Specific test results注：CH1為流研中心疫苗株，CH2為新疆天康疫苗，CH3為新疆株樣本，CH4為西藏株樣本，CH5為犬瘟熱病毒樣本，CH6-CH8為空白

圖3 RT-LAMP法天康疫苗和疫苗株（N75-1）敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Result o f sensitivity assay of Tiankang vaccines and vaccine strains（N75-1）注：CH1～CH5依次為T原濃度和4個(gè)梯度稀釋；CH6～CH8依次為Y原濃度和2個(gè)梯度稀釋

圖4 RT-LAMP法疫苗株(N75-1)和西藏株敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Resu lt of sensitivity assay o f Tiankang vaccines and vaccine strains（N75-1）注：CH1-CH5依次為T原濃度和4個(gè)梯 vaccine st rains（N75-1） and Xizang st rains

圖5 RT-LAMP法西藏株敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Resu lt of sensitivity assay o f Xizang strains注：CH1～CH4依次為X的4個(gè)梯度稀釋；CH5～CH8為空白。

圖6 RT-PCR法天康疫苗敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Result o f sensitivity assay o f Tiankang vaccin es注：1～5依次為天康疫苗原濃度和4個(gè)梯度稀釋。

圖7 RT-PCR法疫苗株（N75-1）敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Resu lt of sensitivity assay o f vaccine strains（N75-1）注：1～6依次為疫苗株（N75-1）原濃度和5個(gè)梯度稀釋。

圖8 RT-PCR法西藏株敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Result o f sensitivity assay of Xizang strains注：1～7依次為西藏株原濃度和6個(gè)梯度稀釋。

表3 小反芻獸疫臨床樣本檢測(cè)結(jié)果Table3 Results o f clinica l samp les test o f PPRV

3 討論

由于LAMP具有檢測(cè)方法簡單、檢測(cè)用時(shí)短、不需要復(fù)雜儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用到了多種病原微生物的檢測(cè)。對(duì)于LAMP產(chǎn)物的檢測(cè)方法，目前有四種：一是傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，二是眼觀白色沉淀檢測(cè)法，三是熒光指示劑法，四是濁度儀檢測(cè)法。前三種方法為目前比較普遍的試驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)法，但是不足在于無法判定反應(yīng)中是否出現(xiàn)污染、二聚體擴(kuò)增等假陽性情況，從而得不到準(zhǔn)確、高效的反應(yīng)體系。

本試驗(yàn)中，利用了濁度儀，采用實(shí)時(shí)濁度法可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的白色焦磷酸鎂沉淀，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)LAMP整個(gè)反應(yīng)過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控。通過對(duì)曲線形態(tài)的分析，能夠客觀準(zhǔn)確的排除假陽性結(jié)果；通過沉淀產(chǎn)生的起始時(shí)間判斷反應(yīng)的進(jìn)行程度；通過濁度值的高低和反應(yīng)開始時(shí)間的快慢來確定最佳反應(yīng)體系。

本試驗(yàn)根據(jù)實(shí)時(shí)濁度法進(jìn)行小反芻獸疫病毒RT-LAMP檢測(cè)，特異性試驗(yàn)結(jié)果表明該反應(yīng)體系能夠檢測(cè)出不同種類的小反芻獸疫病毒，而不與同屬的其他種類病毒發(fā)生反應(yīng)。靈敏性試驗(yàn)表明，其靈敏性與Real-time RT-PCR靈敏性相當(dāng)；臨床樣本試驗(yàn)表明，在實(shí)際應(yīng)用中，其對(duì)陽性樣本的檢出率與RT-PCR檢測(cè)試劑盒一致。針對(duì)各類樣本檢測(cè)，本試驗(yàn)方法均能在40 min以內(nèi)出現(xiàn)擴(kuò)增，并在50 min以內(nèi)進(jìn)行結(jié)果判定，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。以上結(jié)果表明，本試驗(yàn)體系能夠簡便、快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行小反芻獸疫病毒檢測(cè)，在臨床應(yīng)用中，只需要普通的恒溫金屬浴或水浴鍋設(shè)定具體的反應(yīng)溫度即可進(jìn)行小反芻獸疫病毒的檢測(cè)和鑒別，因此具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

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DevelopmentResearch of RT-LAMP for Detection of Peste des Petisrum inants Virus

Yang Zhuo1,2,Yu Hanxun1,2,Li Wei1,2
（1.Dal ian Animal Disease Prevention and Cont rol Center，Liaoning Dal ian 116037；2.Dal ian Animal Husbandry Station，Liaoning Dal ian 116037）

real-time turbidity method which was based on reverse-t ranscription loop-mediated ampl if ication(RT-LAMP)was developed for the detection of peste des petisruminants virus(PPRV)Using turbiditymeter.The resul ts indicated that the detection of PPRV test could be f inished in 50 min at 65℃.The sensitivity of Real-time RT-PCR test resul t indicated that there was no cross-reaction with other related viruses,the accuracy of Real-time RT-PCR test resul t was as wel l as RTPCR detection kit of PPRV.

Real time turbidity method;Peste des petisruminants virus;Detection

S852.659.5

1672-9692(2015)07-0008-07

2015-05-23

楊卓（1983-），女，大學(xué)本科，獸醫(yī)師，研究方向：動(dòng)物疫病診斷及防控。

于漢勛（1965-），男，大學(xué)本科，研究員級(jí)高級(jí)獸醫(yī)師，研究方向：動(dòng)物疫病診斷及防控。