謝綿測，李先國，張大海

中國海洋大學化學化工學院，青島 266100

微生物次級代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多樣性賦予其廣泛的生物活性，是藥物先導化合物的重要來源［1］，然而實驗室傳統(tǒng)單一的培養(yǎng)模式，使微生物中大量的合成基因簇［2］處于休眠狀態(tài)，使大量的代謝途徑不能被表達，導致次級代謝產(chǎn)物的數(shù)量較少，骨架結(jié)構(gòu)也偏于單一［3］，對微生物資源造成了極大的浪費。同時，由于研究的不斷深入，使得天然微生物資源逐漸稀缺，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎，高活性的新化合物難度越來越大。針對這些難點問題，研究人員開始嘗試改變微生物的培養(yǎng)環(huán)境以刺激微生物做出不同的代謝反應。2002年，Zeeck 等［4］在前人的基礎上歸納提出了單株菌多次級代謝產(chǎn)物(one strain-many compounds，OSMAC)策略，即OSMAC 策略。OSMAC 策略強調(diào)通過改變培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和添加酶抑制劑等干擾因素來刺激微生物，激活不同的合成基因簇，挖掘其產(chǎn)生不同次級代謝產(chǎn)物的能力，從而獲得骨架新穎，活性高的新化合物。

煙曲霉菌(A.fumigatus)是自然界中最常見的陸生致病霉菌之一，能夠產(chǎn)生多種真菌毒素類化合物，能引起人、畜和禽類的多種疾病，如肺曲霉病等。較早的學者多關注于A.fumigatus 代謝的真菌毒素及其致病機理和防治，而忽略了其對人類有益的方面。近年來隨著開發(fā)海洋的熱潮，多個課題組研究發(fā)現(xiàn)該菌株可以來源于海洋，并從其次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了多個具有抗腫瘤活性的化合物［5］，這使得研究人員對A.fumigatus 次級代謝產(chǎn)物研究產(chǎn)生了極大的動力。隨著OSMAC 策略的提出，研究人員嘗試將其應用于煙曲霉次級代謝產(chǎn)物研究，大大提高了新化合物和活性化合物的發(fā)現(xiàn)幾率。本文綜述了以海洋來源A.fumigatus ZTF001 為研究對象，應用OSMAC 策略研究所取得的成果。

1 OSMAC 策略

1.1 培養(yǎng)基對微生物次級代謝產(chǎn)物的影響

1.1.1 C、N 源及C/N 比

碳源為菌體的生長繁殖提供能源和合成菌體所需的必要成分，也為次級代謝產(chǎn)物提供所需的碳素成分。不同的碳源在分子結(jié)構(gòu)上有著顯著的差異，微生物在生物轉(zhuǎn)化過程中也會表現(xiàn)出差異性，常見的碳源有糖類、油脂、有機酸和低碳醇等。在特殊情況下(如碳源匱乏時)，蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物以及氨基酸等也能被微生物作為碳源使用。氮源主要用于提供合成細胞質(zhì)和細胞中其他結(jié)構(gòu)的原料，很少用作能量來源，且氮源消耗會導致培養(yǎng)環(huán)境中pH的變化。研究發(fā)現(xiàn):C/N 比對菌體的生長繁殖以及次級代謝產(chǎn)物有極大的影響。碳源過多，易形成較低的pH，影響微生物生長;碳源不足則會引起微生物本體的衰老和自溶。氮源過多，會使菌體生長過旺，pH 偏高，不利次級代謝產(chǎn)物的積累;而氮源不足則時菌體繁殖量少，直接影響次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。

1.1.2 鹽度和金屬離子

鹽度能影響微生物的生長量和次級代謝產(chǎn)物。鹽度的高低直接決定體系滲透壓的大小，而適當?shù)臐B透壓是微生物正常生長的保障［6］。劉琳等［7］在乳酸菌發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn)，由于細胞壁的保護，低滲透壓對微生物影響不大，但高滲透壓易使細胞脫水而影響微生物的生化反應。Miller［8］和Masuma［9］等人在研究鹽度對Aspergillus sp.、Penicillium sp.、Fusarium sp.、Cladosporium sp.等24 株海洋來源真菌的次級代謝產(chǎn)物及其抗菌活性影響時，發(fā)現(xiàn)鹽度的適當增加有助于其次級代謝產(chǎn)物抗菌活性的提高。

金屬離子與微生物的生理結(jié)構(gòu)和功能息息相關，在生物化學反應中起到重要的作用(表1)。

表1 常見金屬離子的主要生理作用［10］Table 1 Common physiological functions of metal ion

多個研究小組通過改變或添加金屬離子培養(yǎng)微生物而獲得了一系列新型化合物。Priyani 等［11］僅把培養(yǎng)基中的自來水換成蒸餾水，內(nèi)生真菌Paraphaeosphaeria quadriseptata 的代謝就發(fā)生根本性變化，主要次級代謝產(chǎn)物改變?yōu)閏ytosporones F-I(1～4)、quadriseptin A(5)和5'-hydroxymonocillin III(6)(圖1)。而Wang WJ 等［12］將一定量的Mg2+加入到培養(yǎng)基中，從海洋來源真菌Ascotricha sp.ZJ-M-5 中獲得了3 個結(jié)構(gòu)新穎的石竹烯類化合物(7～9)(圖1)。

1.1.3 培養(yǎng)體系中pH 值

圖1 化合物1～9 的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1-9

在微生物培養(yǎng)過程中，營養(yǎng)物質(zhì)被分解利用和次級代謝產(chǎn)物的形成與積累，均會導致培養(yǎng)體系pH值發(fā)生變化，其不僅對各種酶活產(chǎn)生影響，還會影響膜表面電荷的性質(zhì)及膜的通透性，改變菌體對基質(zhì)的利用速率，從而影響菌的生長和產(chǎn)物的合成［13］。培養(yǎng)體系pH 的變化影響微生物的代謝過程，導致次級代謝產(chǎn)物的差異性，科研工作者利用微生物的這一特性，通過調(diào)節(jié)pH 獲取目標產(chǎn)物的最佳產(chǎn)率。各類抗生素生物合成工業(yè)生產(chǎn)中，金霉素和四環(huán)素最佳pH 為5.9～6.3、青霉素為6.5～6.8、鏈霉素和紅霉素為6.8～7.3。而阮復昌等［14］在研究Aspergillums niger 的次級代謝產(chǎn)物時發(fā)現(xiàn)，pH 2～2.5 時以合成檸檬酸為主;當pH 在2.5～6.5 時，以菌體生長為主，較少有次級代謝產(chǎn)物;而在pH 升至7.0時，則主要合成草酸。

1.2 培養(yǎng)條件對微生物次級代謝產(chǎn)物的影響

1.2.1 培養(yǎng)溫度

微生物的自身生長和生物化學反應，均需要在其各自適宜的溫度下進行。從酶反應動力學角度分析，溫度升高，酶活性變大，反應速率加快，微生物生長代謝速率提升，產(chǎn)物生成提前，但溫度越高，酶失活速率也越快，反而影響次級代謝產(chǎn)物的生成［15］。此外，溫度還通過改變發(fā)酵液的理化性質(zhì)(如溶解氧、基質(zhì)傳遞速率、各營養(yǎng)成分的溶解度和吸收速率等)來間接影響次級代謝產(chǎn)物的合成、分泌和類型。以鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)金霉素［16］為例，溫度低于30 ℃時，該菌以合成金霉素為主，隨著溫度的提高，產(chǎn)物中四環(huán)素的比例不斷增加，當溫度升高到35 ℃時，則只產(chǎn)生四環(huán)素而無法合成金霉素。

1.2.2 培養(yǎng)狀態(tài)

培養(yǎng)狀態(tài)主要包括固態(tài)和液態(tài)、靜態(tài)和動態(tài)，狀態(tài)的不同也能直接影響微生物的代謝過程。相比于固態(tài)和靜態(tài)培養(yǎng)，液態(tài)和動態(tài)培養(yǎng)不僅保證了菌體與營養(yǎng)成分的充分接觸，還能通過供氧量的變化來影響菌株的生化反應，激活不同的功能基因簇而產(chǎn)生不同的次級代謝產(chǎn)物。菌株Chaetomium chiversil［11］在固態(tài)培養(yǎng)基中主要代謝產(chǎn)生radicicol(10)(圖2)，而在液態(tài)培養(yǎng)基中則主要代謝合成Chaetomium A(11)(圖2)。

圖2 化合物10～12 的化學結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of compounds 10-12

1.2.3 培養(yǎng)時間

培養(yǎng)時間也是微生物生長發(fā)酵過程的重要因素之一，直接影響次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量。如果培養(yǎng)時間過短，微生物不能達到有效的生長量且影響次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量;而培養(yǎng)時間太長，微生物則會因為培養(yǎng)基的營養(yǎng)不足或自身產(chǎn)生的毒素而逐漸凋亡［7］，甚至有些次級代謝產(chǎn)物發(fā)生分解或異構(gòu)化而影響次級代謝產(chǎn)物類型和產(chǎn)量。Kepler 等［17］研究乳酸菌轉(zhuǎn)化亞油酸時發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時間的延長，部分共軛亞油酸能夠進一步轉(zhuǎn)化生成其他非目標物。

1.3 酶抑制劑對微生物次級代謝產(chǎn)物的影響

通過酶抑制劑的添加，選擇性的抑制代謝途徑中相關酶的活性，在抑制某些代謝途徑的同時，促進其他通路相關代謝產(chǎn)物的合成［1］。例如在工業(yè)生產(chǎn)過程中，在酵母厭氧發(fā)酵時加入亞硫酸或堿類物質(zhì)，能夠抑制酒精發(fā)酵，從而轉(zhuǎn)入甘油發(fā)酵。常用抗生素的生物合成過程中，常常通過添加抑制劑來控制產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)率，綜合文獻資料，常見抗生素所對應的酶抑制劑如表2。

表2 常見抗生素及其對應的酶抑制劑Table 2 Common antibiotics and their corresponding enzyme inhibitors

1.4 OSMAC 策略新思路

隨著研究人員的不斷探索和新型儀器分析技術的發(fā)展，OSMAC 策略研究提出了新的思路和方法，歸納為微生物的混合培養(yǎng)和基于基因組掃描技術(genome scanning)的高通量篩選。

微生物的混合培養(yǎng)能夠發(fā)生協(xié)同或者拮抗作用，進而使微生物產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、高活性的次級代謝產(chǎn)物，這是近年來OSMAC 策略在微生物次級代謝產(chǎn)物研究方面的新思路。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，天然來源的抗生素多是由于微生物的生存環(huán)境受其它物種威脅而產(chǎn)生的一種化學防御武器，探索這種防御機制是尋找新抗生素的有效途徑［18］。Clardy 等［19］在海洋真菌Pestalotia sp.CNL-365 和海洋細菌CNJ-328 混合培養(yǎng)的次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了新型抗生素pestlone(12)(圖2)，而分別單獨培養(yǎng)時并未發(fā)現(xiàn)該化合物。

控制微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成的功能基因通常成簇分布于其染色體的某一區(qū)域，根據(jù)基因-合成酶系-化合物的對應關系，通過篩選、測序、定位和表達該特定的生物合成基因簇，可以針對性地獲得特定結(jié)構(gòu)的次級代謝產(chǎn)物，從而充分發(fā)掘微生物次級代謝的潛力，為新藥發(fā)現(xiàn)提供更多天然來源或其前驅(qū)體。Banskota 等［20］掃描了2 株鏈霉菌Streptomyces sp.Eco86 和 Streptomyces aculeolatus NRRL 18422 的基因序列，發(fā)現(xiàn)二者均含有編碼I 型PKS和Baeyer-Villiger 單加氧酶的基因簇，將這2 株菌進行發(fā)酵研究，結(jié)合所預測化合物的MS 和UV 等理化數(shù)據(jù)，成功激活了這2 個基因簇，獲得3 個結(jié)構(gòu)類似的5-鏈烯基-3，3(2H)-呋喃酮類活性化合物E-837、E-492、E-975(13-15)(圖3)。文孟良等［2］則歸納提出了利用基因掃描技術與OSMAC 策略相結(jié)合獲得新化合物的平臺模式:

圖3 化合物13～15 的化學結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of compounds 13-15

隨著基因掃描技術的不斷發(fā)展，與OSMAC 策略結(jié)合的力度也將不斷地加大，將為更多結(jié)構(gòu)新穎和高活性次級代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)提供有力的支持。

2 OSMAC 策略下的煙曲霉代謝產(chǎn)物

本課題組從日本奄美大島海葵中分離純化出一株A.fumigatus ZTF001，采用YPG 培養(yǎng)基培養(yǎng)，主要得到化合物Pyripyropene A(16)(圖4)，一種穩(wěn)定的啶南平衍生物，能選擇性抑制ACAT2 的代謝酶，主要用于預防或治療動脈硬化癥，到目前為止僅能來源于微生物。根據(jù)OSMAC 策略，我們改變了培養(yǎng)基的組成，將YPG 培養(yǎng)基改為Malt 培養(yǎng)基，而其他培養(yǎng)條件不變(37 ℃，靜置培養(yǎng)14 d)，獲得了7 個次級代謝產(chǎn)物(17～23)(圖4)，其中化合物17 和18 為新化合物(見文獻［21］)。相比于YPG 培養(yǎng)基，菌株在Malt 培養(yǎng)基上生長較為迅速，且外觀上與YPG 培養(yǎng)時有較大差異，次級代謝產(chǎn)物類型和數(shù)量也相對較多。YPG 和Malt 培養(yǎng)基的差異主要在于C、N 源的來源不同，同時C/N 存在較大的差異，分別為富碳和富氮型培養(yǎng)基。C、N 源的差異性以及C/N 的不同能夠刺激菌株做出不同的生化反應，表明該菌對培養(yǎng)基成分比較敏感，能夠激活功能基因簇，進而產(chǎn)生不同的代謝途徑，代謝出不同的次級代謝產(chǎn)物。

圖4 化合物16～23 的化學結(jié)構(gòu)Fig.4 Structures of compounds 16-23

近十幾年來，研究人員通過培養(yǎng)基成分的調(diào)整和培養(yǎng)條件的變化來刺激A.fumigatus，先后提取分離次級代謝產(chǎn)物得到的新化合物33 個，具有活性的化合物31 個，具有新骨架結(jié)構(gòu)化合物5 個(詳見表3)，證實了不同的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件對A.fumigatus 的代謝途徑的確有著巨大重大的影響。

表3 OSMAC 策略下，A.fumigatus 次級代謝產(chǎn)物分布情況Table 3 The distribution of microbial secondary metabolites under OSMAC

3 結(jié)論

微生物生存環(huán)境的復雜多樣性能夠刺激其不同合成基因簇的表達，促使其次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的多樣性，而結(jié)構(gòu)的多樣性賦予了其活性的多樣性。OSMAC 策略通過改變微生物的生存環(huán)境來刺激微生物，使其做出不同的生化反應，產(chǎn)生不同的次級代謝產(chǎn)物，能為新藥的研制提供新的來源或其前驅(qū)體。以A.fumigatus 研究為例，對比不同培養(yǎng)條件下，該菌株次級代謝產(chǎn)物的差異性，印證了OSMAC 策略在菌株次級代謝產(chǎn)物研究中的可行性和潛在價值，并從中分離得到了2 個新化合物，雖然OSMAC 策略研究目前還存在一定的盲目性，但對已知的微生物的再培養(yǎng)和再開發(fā)不失為應對天然產(chǎn)物資源枯竭危機的新方法和思路。隨著微生物基因組學的發(fā)展和代謝機制研究的深入，OSMAC 策略定將為微生物次級代謝產(chǎn)物的發(fā)展帶來新的生機。

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