朱林強(qiáng) 周永焯 謝曉明 賴洪珍 呂敏儀 張銀霞 陳盛強(qiáng) 許 衛(wèi)伍金雷 陳晞明

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是多種心血管疾病的最終歸宿，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量和健康水平，它給家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神痛苦，CHF 現(xiàn)已成為全世界嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題［1］。因CHF 相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究不能直接在病人身上進(jìn)行，故CHF 動(dòng)物模型越來越廣泛的被應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究中。所以建立一種穩(wěn)定、可靠的動(dòng)物心衰模型對進(jìn)一步研究該類疾病有重要意義。現(xiàn)今眾多CHF 模型建立方法中，腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)因經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、操作簡單而成為CHF 實(shí)驗(yàn)研究的常用模型。本組參照Anned 等［2］腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)制備大鼠壓力超負(fù)荷性慢性心力衰竭模型［3］，從建模步驟、超聲心動(dòng)圖結(jié)果、心臟病理結(jié)構(gòu)等方面評價(jià)此方法的可行性，并就如何建立穩(wěn)定可靠的大鼠心力衰竭模型步驟展開討論。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

八周齡健康雄性SD 大鼠共48 只，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF 級，動(dòng)物編號:SCXK(粵)2013 -0002)，于廣州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)兩天(清潔級)，體重220 ～270 g。隨機(jī)分為A、B 兩組(A 組24 只，為模型組;B組24 只，為對照組)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料飼養(yǎng)，自由攝食飲水，溫度23 ～25 ℃，濕度55% ～70%。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備

1.2.1.1 術(shù)前8 小時(shí)禁食，自由飲水。

1.2.1.2 保持實(shí)驗(yàn)室室溫為25 ～30 ℃，術(shù)中使用落地手術(shù)燈為手術(shù)提供光源，同時(shí)利于維持大鼠正常體溫。

1.2.2 詳細(xì)操作

1.2.2.1 大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位，固定四肢，腹部手術(shù)區(qū)備皮，消毒，并鋪一次性無菌紗布。

1.2.2.2 于劍突下2 ～3 cm，腹正中切口，沿腹白線逐層切開皮膚及肌肉至劍突，暴露腹腔。

1.2.2.3 用手指在大鼠左側(cè)背部向腹腔輕推，將胃體、脾臟一并擠出，外翻置于生理鹽水濕潤的紗布之上，固定，隨后用脫脂棉球?qū)⒆髠?cè)肝臟向上輕推，充分暴露腹膜以及左側(cè)腎臟。

1.2.2.4 視野可見明顯的左腎靜脈，于腎靜脈水平沿腹主動(dòng)脈上1.5 ～2 cm 處可用手指觸及明顯搏動(dòng)感，用兩只彎鑷在此輕緩鈍性分離，剝離腹主動(dòng)脈血管鞘，分離腹主動(dòng)脈，隨之在其下穿過長約8 cm 的4 ～0 手術(shù)縫線(術(shù)前置于生理鹽水中濕潤)，留置備用。

1.2.2.5 將磨鈍的7 號針頭與腹主動(dòng)脈平行緊貼血管放置，用留置的4 ～0 手術(shù)縫線將腹主動(dòng)脈與7 號針頭一起結(jié)扎，結(jié)扎后馬上可觸及結(jié)扎處下方動(dòng)脈脈搏明顯減弱、左腎缺血變白(見圖1)，迅速提起兩邊縫線同時(shí)輕柔的抽出針頭，剪去過長的縫線。

圖1 腹主動(dòng)脈縮窄前后腎的血供對比

1.2.2.6 檢查大鼠腹腔內(nèi)無殘留紗布、棉球后，將胃體、脾等小心放回腹腔復(fù)位，逐層縫合肌肉和皮膚，消毒。

1.2.2.7 空白對照組大鼠按手術(shù)操作分離腹主動(dòng)脈并穿線，但不做縮窄處理，縫合，消毒。

1.2.2.8 全部大鼠于術(shù)后肌注50 000 U/只青霉素抗感染，連續(xù)注射3 天。術(shù)后密切觀察并記錄大鼠生存情況、體重以及精神狀態(tài)、呼吸，飲水飲食、毛色、活動(dòng)力等臨床表現(xiàn)。

1.3 大鼠彩色超聲心動(dòng)圖檢查

大鼠造模后4 周、8 周各行一次，10% 水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后取仰臥位固定大鼠，備皮，運(yùn)用超聲診斷儀，胸骨旁左室長軸切面及腹主動(dòng)脈長軸切面，檢測大鼠:LVPWs，LVPWd，IVSs，IVSd，LVEF。

1.4 大鼠灌注固定取心臟組織，制石蠟切片，行HE 染色、馬松染色

大鼠建模8 周后，用10%水合氯醛麻醉，仰臥位固定，開胸腔暴露心臟，灌注針頭從心尖進(jìn)入，固定在升主動(dòng)脈，剪開右心耳，4 ℃生理鹽水灌流3 min，再用4℃多聚甲醛灌注固定40 min，固定完畢取大鼠心臟送病理科做石蠟切片，常規(guī)HE 染色、馬松染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠分組建模成功率及術(shù)后觀察結(jié)果

建模后1 周共存活大鼠42 只，其中模型組大鼠成活18只，死亡6 只，成活率為75%，其中一只下肢活動(dòng)不便，疑為縮窄動(dòng)脈后下肢血流灌注不足所致，棄去不用;2 只死于術(shù)后，解剖未見明顯感染，無腹腔積液;4 只死于術(shù)后72 h 圍手術(shù)期，解剖未見異常，疑為手術(shù)應(yīng)激［4］，對照組全部存活。

與對照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)鼠毛蓬松、稀疏、干燥無光澤，活動(dòng)力降低，呼吸頻率加快，體重增長緩慢等表現(xiàn)，且上述表現(xiàn)隨建模時(shí)間增長而愈加明顯;到8 周時(shí)可出現(xiàn)呼吸急促、對外界刺激反應(yīng)遲鈍、尾巴紫紺和輕度水腫等心力衰竭體征，表明模型組大鼠心功能下降，全身組織血液灌注減少，有缺血缺氧癥狀。

2.2 建模4 周與8 周超聲心動(dòng)檢查結(jié)果

建模4 周后A 組大鼠LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd 均增加(p ＜0.05)，LVEF 雖有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p ＞0.05)，結(jié)果見表1，結(jié)果提示在建模4 周后大鼠已經(jīng)出現(xiàn)心室肌肥厚的改變，但未達(dá)到心力衰竭。建模8 周后LVPWs(0.297 ± 0.020 vs 0.374 ± 0.023)mm、p ＜0.05，LVPWd(0.192 ±0.009 vs 0.290 ±0.028)mm、p ＜0.05，IVSs(0.311±0.008 vs 0.364 ±0.012)mm、p ＜0.05，IVSd(0.187 ±0.008 vs 0.225 ±0.023)、p ＜0.05，LVEF(86.586 ±1.452 vs 60.630±2.716)、p ＜0.05，此時(shí)差異更加明顯，LVEF 出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p ＜0.05)，見表1，結(jié)果提示心臟逐漸失去代償能力，轉(zhuǎn)向心力衰竭;同時(shí)通過腹主動(dòng)脈B 型超聲超成像可見模型組大鼠腹主動(dòng)脈縮窄明顯，220 ～270 g 的大鼠使用7 號針頭縮窄后腹主動(dòng)脈縮窄可達(dá)60% ～70%;而對照組大鼠心臟結(jié)構(gòu)、射血分?jǐn)?shù)均正常。對照組大鼠未見異常，見圖2。

表1 兩組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較(±s)

表1 兩組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較(±s)

注:收縮末期左室后壁厚度(LVPWs)，舒張末期左室后壁厚度(LVPWd)，收縮期室間隔厚度(IVSs)，舒張末期室間隔厚度(IVSd)，左心射血分?jǐn)?shù)(LVEF);本厚度是以胸骨左室長軸切面，以主動(dòng)脈影為統(tǒng)一參照標(biāo)準(zhǔn)，測量各壁厚度;1)p ＜0.05，2)p ＞0.05

組別n時(shí)間(W) LVPWs(mm)LVPWd(mm)IVSs(mm)IVSd(mm)LVEF(mm)B 組2440.276 ±0.0050.171 ±0.0080.278 ±0.0070.167 ±0.00490.483 ±1.832 80.297 ±0.0200.192 ±0.0090.311 ±0.0080.187 ±0.00886.586 ±1.452 A 組1740.355 ±0.0151) 0.264 ±0.0121) 0.327 ±0.0601) 0.228 ±0.0131) 81.600 ±1.3112)80.374 ±0.0231) 0.290 ±0.0281) 0.364 ±0.0121) 0.225 ±0.0231) 60.630 ±2.7161)

圖2 腹主動(dòng)脈B 型超聲成像縮窄效果及血流對比

2.3 HE 染色病理結(jié)果

圖中心肌組織細(xì)胞核均被染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)、膠原纖維、紅細(xì)胞均被染成紅色。A 組大鼠心肌細(xì)胞體積增大、數(shù)量減少、間隙增寬、排列紊亂;胞核著色不均、心肌肌節(jié)增多、肌纖維間疏松水腫。B 組心肌排列整齊，組織學(xué)表現(xiàn)正常。見圖3。

2.4 馬松染色結(jié)果

圖中藍(lán)色部分代表心肌間質(zhì)膠原成份，細(xì)胞質(zhì)、心肌纖維、紅細(xì)胞被染成深淺不一的紅色。由圖可見A 組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維增多，血管周圍細(xì)胞外基質(zhì)增多，圖B、圖D 可見成片被染成藍(lán)色的膠原纖維，將心肌分隔成島狀。見圖4。

圖3 心肌HE 染色結(jié)果(×400)

圖4 心肌馬松染色結(jié)果(A、B×200，C、D×400)

3 討論

動(dòng)物CHF 模型建立的方法有多種，常用的有以下三種［5-6］:①容量超負(fù)荷建模(包括動(dòng)靜脈造瘺法，腔靜脈縮窄與主動(dòng)脈瓣和二尖瓣關(guān)閉不全法);②壓力超負(fù)荷建模(包括主動(dòng)脈縮窄和肺動(dòng)脈縮窄法);③化學(xué)因素造成(主要有采用阿霉素法)。以上幾種方法都存在一定的局限性，例如操作精確度不高或者建模一定時(shí)間后動(dòng)物之間心衰程度有較大差別等［7-8］。除此之外，近年來蘆玲巧［9］等人使用主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)制備大鼠CHF 模型以及張冬穎［10］等人使用冠脈結(jié)扎術(shù)建立該模型，相比本課題組采用的腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)達(dá)到理想心力衰竭狀態(tài)的耗時(shí)較短，但其手術(shù)操作復(fù)雜、大鼠術(shù)后死亡率高，且必需呼吸機(jī)支持。

心室重構(gòu)是CHF 的病理生理基礎(chǔ)，超聲心動(dòng)圖檢查心臟功能、評價(jià)心力衰竭等方面具有無創(chuàng)傷，動(dòng)態(tài)監(jiān)測方便等優(yōu)點(diǎn)［15］。本實(shí)驗(yàn)用超聲心動(dòng)圖、HE 染色和馬松染色下心肌病理變化反映大鼠心室重構(gòu)。可見建模8 周大鼠有顯著的心室壁增厚肥大、心腔擴(kuò)大;組織學(xué)上表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂、間質(zhì)增生、心肌間質(zhì)纖維化、間隙增寬、細(xì)胞核濃染增大、著色不均、心肌肌節(jié)增多、肌纖維間疏松水腫等特點(diǎn)。此外，結(jié)合臨床水腫發(fā)紺等癥狀，可知按照此方法可以較穩(wěn)定的制備出大鼠慢性心力衰竭模型，并由手術(shù)操作簡易、術(shù)后大鼠存活率高以及8 周后大鼠CHF 表現(xiàn)，可知本方法是一種較理想的CHF 模型建立方法。

采用腹主動(dòng)脈部分縮窄術(shù)時(shí)，大鼠腹主動(dòng)脈縮窄后腎血流量顯著減少，激活RAAS 系統(tǒng)并造成體內(nèi)鈉水潴留，加重心衰［11］。一方面增加壓力后負(fù)荷，另一方面通過減少腎血流量致鈉水潴留、增加前負(fù)荷，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)激活增加使AngⅠ轉(zhuǎn)化為AngⅡ，后者可使血管強(qiáng)烈收縮，加重心臟后負(fù)荷，引起心肌重構(gòu)，形成惡性循環(huán)［12］。故本建模方法尤其適合研究由壓力負(fù)荷過大而致的心肌肥厚并且從心衰代償期到失代償期病理及臨床表現(xiàn)的變化，并通過腹主動(dòng)脈的機(jī)械性縮窄直接導(dǎo)致心臟射血的后負(fù)荷增加，從而形成了不易受藥物影響的穩(wěn)定的高血壓，更利于研究從高血壓致心肌肥厚并轉(zhuǎn)變成慢性心力衰竭的各種病理改變，與臨床有較好的相關(guān)性［13-14］。因此，腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)致動(dòng)物心力衰竭模型值得推廣使用。

本課題組采用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)制備大鼠CHF 模型，根據(jù)建模的效果思考總結(jié)，得出建模過程中的注意事項(xiàng):

①術(shù)前8 小時(shí)禁食，否則手術(shù)中鼓脹的胃體會影響分離腹主動(dòng)脈的手術(shù)視野，胃附近連著脾處有大量血管，在隔離過程中也容易損傷導(dǎo)致大出血。

②開腹時(shí)要逐層剪開，避免傷到小血管造成出血。同時(shí)在剪開最后一層時(shí)需要用鑷子提起來再剪，防止鋒利的剪刀直接剪破內(nèi)臟。

③暴露手術(shù)視野時(shí)，腸管、胃體、脾的隔離固定需用經(jīng)生理鹽水濕潤過的紗布，同時(shí)在手術(shù)中注意保持濕潤。若肝葉擋住視野可放置小棉球進(jìn)入腹腔頂住肝臟使不其下垂，但切記放入小棉球位置和數(shù)量，方便術(shù)后取出。

④分離腹主動(dòng)脈動(dòng)作要輕柔，注意避開附近小的血管，防止術(shù)中出血，出血一方面影響手術(shù)視野，同時(shí)也降低手術(shù)后成活率。另外，不必分離過長腹主動(dòng)脈，可容4 -0 手術(shù)縫線順利穿過即可。

⑤結(jié)扎松緊度的判斷:腹主動(dòng)脈結(jié)扎的松緊程度是縮窄程度的重要影響因素，結(jié)扎緊后立即可觀察到如圖1 左腎明顯缺血變白，結(jié)扎后向外輕拉針頭，以針頭有明顯阻力，不向外滑脫為宜。

⑥結(jié)扎部位的選擇:結(jié)扎部位需謹(jǐn)慎，多在左腎靜脈水平沿腹主動(dòng)脈向上1.5 ～2 cm 處將腹主動(dòng)脈于7 號針頭共同結(jié)扎，結(jié)扎點(diǎn)選擇過上會增加分離腹主動(dòng)脈難度且在分離過程中易損傷膈膜導(dǎo)致氣胸;結(jié)扎點(diǎn)過低則可能結(jié)扎在右腎動(dòng)脈分叉處以下，則不能導(dǎo)致大鼠心臟后負(fù)荷明顯增加而難以造成心力衰竭。

⑦術(shù)后腸粘連腸梗阻的預(yù)防:術(shù)前備皮需盡量清理干凈，防止開腹后鼠毛進(jìn)入腹腔。術(shù)前洗去乳膠手套上滑石粉后進(jìn)行手術(shù)操作，術(shù)前準(zhǔn)備濕潤紗布鋪于切口左側(cè)，術(shù)中需用生理鹽水保持外露腸胃濕潤，術(shù)后確認(rèn)放置進(jìn)腹腔的棉球全部取出后自然復(fù)位胃、脾和腸管。

⑧大鼠麻醉后體溫下降，故術(shù)中和術(shù)后都需注意保暖。

⑨術(shù)后可喂養(yǎng)8 小時(shí)糖鹽水(4%葡萄糖、0. 9%氯化鈉)，同時(shí)觀察大鼠是否有排便腹脹等情況以便確認(rèn)是否有腸粘連梗阻，并需勤換飼養(yǎng)墊料，保持自然環(huán)境清潔。

⑩對4 周及8 周建模大鼠行超聲時(shí)需要麻醉固定，但由于八周時(shí)大鼠心功能不全，建議減量注射麻醉藥，以防麻醉過深導(dǎo)致大鼠意外死亡。

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