曹翌明 李 麗 孟繁榮 劉志輝

利福平(rifampicin，RFP)作為目前結(jié)核病短程化療的關(guān)鍵藥物，其主要作用機制為與結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)RNA 聚合酶β 亞單位結(jié)合而干擾轉(zhuǎn)錄和RNA 延伸。MTB 對RFP 產(chǎn)生耐藥主要因其編碼RNA 聚合酶β 亞單位的rpoB 基因突變所致，這已是不爭的事實，并由此開發(fā)了多種RFP耐藥分子檢測方法［1］。這些方法的研究及其逐步應(yīng)用，為我們掌握MTB rpoB 基因突變的分子特征及它們與耐藥表型之間的關(guān)系積累了豐富的資料。但是單個研究往往樣本量較小，菌株代表性也不強，難能從中抽象出MTB rpoB 基因突變的總體特征。遵從當(dāng)今日益推崇的循證醫(yī)學(xué)理念，于2013 年開始我們即對PubMed 數(shù)據(jù)庫中MTB rpoB 基因突變研究文獻(xiàn)予以密切關(guān)注，并對中國MTB 株的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行循證分析［2-3］。在分析RFP 耐藥MTB 株rpoB 基因507 -533 位利福平耐藥決定區(qū)(rifampin resistance- determining region，RRDR)序列突變特征(相關(guān)數(shù)據(jù)另文發(fā)表)過程中，我們發(fā)現(xiàn)其531、526、516 位點的基因突變各具其特點，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):①研究對象為包括中國大陸及香港、澳門、臺灣來源的RFP 耐藥MTB 株;②研究菌株RFP 耐藥表型明確;③基因突變位點、堿基與氨基酸變化等突變信息均有良好提供。排除標(biāo)準(zhǔn):①重復(fù)報道文獻(xiàn);②二次研究文獻(xiàn);③中、英文以外其它語種發(fā)表的文獻(xiàn)。

1.2 文獻(xiàn)檢索 以“rpoB AND Mycobacterium tuberculosis AND China”、“rpoB AND Mycobacterium tuberculosis AND Hong Kong”、“rpoB AND Mycobacterium tuberculosis AND Macon”和“rpoB AND Mycobacterium tuberculosis AND Taiwan”檢索式在Pubmed 數(shù)據(jù)庫中檢索，末期檢索日期為2015 年3 月31 日。

1.3 文獻(xiàn)篩選 嚴(yán)格按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選文獻(xiàn)，2 名專業(yè)人員獨立閱讀所獲文獻(xiàn)的題目和摘要，在排除明顯不符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)后，對可能符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)查閱(對Pubmed 數(shù)據(jù)庫中非免費全文文獻(xiàn)借助廣東省科技圖書館原文傳遞系統(tǒng)公共平臺獲得)并研讀全文，以確定其是否真正符合納入標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 數(shù)據(jù)提取 由2 名專業(yè)人員獨立選擇文獻(xiàn)、提取資料并交叉核對，意見不一致時由第三位研究者決定取舍。提取的主要資料包括:第一作者姓名、研究機構(gòu)、Pubmed 標(biāo)識碼PMID、文獻(xiàn)發(fā)表年度、菌株來源、研究菌株總數(shù)以及突變類型、位點、堿基變化、氨基酸(AA)變化、突變株數(shù)量(N)等。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 對納入研究文獻(xiàn)的基因突變計數(shù)資料信息進(jìn)行合并計算。

2 結(jié)果

2.1 納入研究的基本特征 依檢索策略檢出130 篇文獻(xiàn)，通過閱讀文題與摘要31 項研究明顯不符合文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn);對所剩99篇文獻(xiàn)進(jìn)行全文查找、研讀全文，最終49 篇文獻(xiàn)納入本研究(包括中文12 篇、英文37 篇)，獲得3 319 株利福平耐藥結(jié)核桿菌中國株rpoB 基因各位點堿基突變的詳細(xì)信息。納入文獻(xiàn)的基本情況見表1。

表1 納入文獻(xiàn)的基本情況

2.2 3 319 株利福平耐藥結(jié)核桿菌中國株rpoB 基因531、526、516 位點堿基突變情況在3 319 株利福平耐藥結(jié)核桿菌中國株中，257 株未檢測到rpoB 基因任何位點的突變，占7.74%;其余3 062株(92.26%)則在rpoB 基因的不同位點檢測到多種不同類型的突變。在3 062 株rpoB 基因突變株中:531、526、516 位點突變的發(fā)生率分別為54.44%(1 667/3 062)、27.07%(829/3 062)和8.92%(273/3 062);531 位點堿基突變以TCG/TTG 突變?yōu)橹鳎?3.58%(1 560/1 667);526 位點堿基突變主要有CAC/GAC、CAC/TAC、CAC/CGC、CAC/CTC、CAC/AAC 等類型，分別占33.53%(278/829)、26.30%(218/829)、13.27%(110/829)、10.13%(84/829)、8.08%(67/829);516 位點堿基突變主要有GAC/GGC、GAC/GTC、GAC/TAC 等類型，分別占35. 53% (97/273)、35.53%(97/273)、16.85%(46/273)。具體情況見表2。

3 討論

對于MTB RFP 耐藥的分子機制，迄今已經(jīng)基本闡明，人們研究發(fā)現(xiàn)約95%左右的RFP 耐藥菌株中存在rpoB 基因突變，且多發(fā)生在rpoB507 ～533 位27 個氨基酸密碼子(81bp)組成的區(qū)域(即前述的利福平耐藥決定區(qū)RRDR)內(nèi)，這與我們對4149 株利福平耐藥MTB 株rpoB 基因RRDR 序列的循證分析結(jié)果(93.64%)相近(相關(guān)數(shù)據(jù)另文發(fā)表)，但是有文獻(xiàn)報道531、526、516 位點的突變率分別為39.9%、34.2%和7.5%［4］，與本文的54.44%、27.07%和8.92%有較大的差別，尤其是531 位點。這可能是此文獻(xiàn)給出的為來自全球研究報道的綜合信息，而本分析結(jié)果則是特對中國MTB 菌株而言，那么其中又蘊藏著一些令人深思的問題。

依據(jù)進(jìn)化論的觀點突變應(yīng)是一種不受環(huán)境影響的隨機發(fā)生過程，這已得到彷徨變異實驗和影印平板等實驗的證實［5］。從本質(zhì)上講，細(xì)菌耐藥基因突變屬于一種進(jìn)化形式，其突變模式也應(yīng)遵從隨機過程的一般規(guī)律。但關(guān)于耐藥結(jié)核病發(fā)生的一般機制，則有優(yōu)勢學(xué)說和順次選擇學(xué)說認(rèn)為:結(jié)核桿菌在繁殖過程中，極少菌株自然突變形成耐藥菌，在抗結(jié)核藥物選擇性壓力存

在情況下，此種自然突變發(fā)生的頻率可能增加［6］。這就說明:在危及細(xì)菌生命安全的情形之下，突變似乎并不完全隨機，而有定向突變的傾向。這對我們深刻理解不同報道間上述位點突變率之間的差異也許有益。我們也許可以如此樸素地思維:531 位的絲氨酸是RFP 最為關(guān)鍵的作用的靶位，MTB 在531 位產(chǎn)生堿基突變是其最為直接和簡化的“趨利避害”方式。另一方面，我們知道:在生物界中，各種生物采用較為通用的遺傳達(dá)室法則，即應(yīng)用64 上可能的三聯(lián)體密碼子中的61 個編碼20 種不同的氨基酸，為降低突變對物種變化的影響，一種氨基酸可能由幾個密碼子編碼，編碼同一氨基酸的多個密碼子僅在第三位堿基上存在差異［7］。但我們可以從表2 看到:MTB rpoB 基因531、526、516 三個位點發(fā)生同義突變(即單獨第三堿基突變)的幾率近乎為零，而多為第一、第二堿基的單堿基突變，這也說明MTB 的耐藥基因突變并非隨機，而是以較為特定的方式。此種特定的方式我們可以總結(jié)為:①堿基突變多導(dǎo)致有義突變;②盡力避開其本身的基因復(fù)制“糾錯機制”，以單堿基突變?yōu)橹?。我們認(rèn)為:在強大的抗結(jié)核藥物環(huán)境壓力下，MTB 以此種最為“經(jīng)濟(jì)”而簡約的方式達(dá)則可較高效率地達(dá)到基因突變的目標(biāo)以利于其生存，符合生物進(jìn)化的一般原則。此種推測是否妥當(dāng)，有等更進(jìn)一步的研究予以證實。

表2 3062 株中國利福平耐結(jié)核桿菌rpoB 基因531、526、516位點突變情況

從表2 還可看到:突變率最高的531 位點堿基突變主類型較為單一，而526、516 位堿基突變主類型則相對分散。為何如此?目前我們不得而知。至于531、526、516 位點與其它位點的聯(lián)合突變，由于發(fā)生率不高，本文未進(jìn)行詳盡分析。這些都有待人們進(jìn)行深入探索。

［1］ LIN SY，DESMOND EP. Molecular diagnosis of tuberculosis and drug resistance［J］. Clin Lab Med. 2014，34(2):297 -314.

［2］ 卓文基，劉志輝，錢 明，等.一線抗菌素結(jié)核藥物不同耐藥表型的利福平耐藥結(jié)核桿菌rpoB 基因突變分析［J］.現(xiàn)代醫(yī)院，2014，14(4):4 -6.

［3］ 孟繁榮，劉志輝，謝 貝，等. 我國利福平敏感結(jié)核桿菌rpoB基因利福平耐藥定區(qū)序列循證分析［J］. 實用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29(21):3601 -3604.

［4］ 吳雪瓊，張宗德，樂 軍.分枝桿菌分子生物學(xué)［M］. 北京:人民軍醫(yī)出版社，2010:125 -139.

［5］ 王鳳陽，杜 麗，何洪彬.細(xì)菌分子遺傳學(xué)(原書第5 版)［M］.北京:科學(xué)出版社，2013:27 -50.

［6］ 唐神結(jié)，許紹發(fā)，李 亮.耐藥結(jié)核病學(xué)［M］. 北京:人民軍醫(yī)出版社，2014:27 -29.

［7］ 江松敏. Lewin 基因Ⅹ［M］. 北京:科學(xué)出版社，2013:762 -793.