金彥召 曹家慶 胡小云 毛盛勛 沈 威 賈驚宇 李正宇 辛 林

淋巴道轉(zhuǎn)移是胃癌主要的轉(zhuǎn)移途徑，除了手術(shù)對淋巴的廓清，全身靜脈化療很難在局部淋巴結(jié)保持有效的藥物濃度，治療效果不理想。淋巴靶向化療概念的提出，有效解決的這個難題，將化療藥物通過淋巴靶向載體在淋巴結(jié)高效濃集，保持淋巴道內(nèi)有效的化療藥物濃度，殺滅癌灶，而血液內(nèi)及重要臟器內(nèi)藥物濃度較低，減輕全身毒副作用。本研究前期將納米級氧化鐵磁性成分、多壁碳納米管、抗腫瘤藥物5 -FU 結(jié)合起來，制備成磁控靶向藥物傳遞系統(tǒng)，通過體外、體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)其對結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定抑制作用，本研究旨在進一步探討磁性碳納米管載附5-FU 對胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型抑制作用。

1 材料和方法

設(shè)計:實驗性研究。

時間及地點:2013 年9 月～2015 年1 月，南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院分子中心實驗室、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物科學(xué)部。

材料:

1.1 試藥與材料

磁性多壁碳納米管(mMWNTs)，北京博宇高科新材料公司;5-氟尿嘧啶(5 -FU):德國Ruibio(進口分裝);pvp k30:德國BASF(進口分裝);SD 大鼠;BALB/cA 裸小鼠，4 ～5 周齡，雌雄各半，體質(zhì)量21.50 ～25.70 g，均購自南昌大學(xué)實驗動物科學(xué)部;SGC7901 細胞株為同行轉(zhuǎn)贈。

1.2 實驗方法

1.2.1 載藥體系的構(gòu)建 mMWNTs、PVP -K30 及5 -FU，按實驗要求比例加入去離子水，35℃，40kHz 超聲分散4h，得到黑色穩(wěn)定的磁性碳納米管混懸液及磁性碳納米管載附5 -氟尿嘧啶混懸液。紫外分光光度法測定載附5 -FU 劑量。

上述方法配制以下藥物。

1.2.2 體外對胃癌細胞的殺傷效應(yīng) 將mMWNTs(3 mg/ml)、mMWNTs-5 -FU(3 mg/ml-12 mg/ml)、5 -FU(12 mg/ml)及空白組加入進入對數(shù)生長期的胃癌SGC7901 培養(yǎng)基中，觀察其在24 h、48 h 和48 h 對細胞的抑制率。

1.2.3 體內(nèi)對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的抑制作用 建立裸鼠胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，選取五周后左側(cè)腘窩淋巴結(jié)直徑0.5 cm 大小時備用。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型隨機分為6 組，每組7 只，共42 只，A 組-生理鹽水組、B 組-5 -FU 單藥組、C 組-mMWNTs(3 mg/ml)空白載體組、D 組-低濃度不加磁場mMWNTs-5-FU(3 mg/ml ～12 mg/ml)組、E 組- 加磁場mMWNTs - 5 - FU(3 mg/ml ～12 mg/ml)組，均于足墊0.1 ml 劑量注射，1、7 天給藥方案化療，左下肢足墊皮下給藥，化療21 天處死裸鼠，按照公式淋巴結(jié)腫瘤和瘤體體積生長抑制率=(1 -治療組平均體積/對照組平均體積)×100%，檢測血白細胞和肌酐。1 ～8 天取腘窩淋巴結(jié)高效液相檢測淋巴結(jié)5 -FU 緩慢釋放情況，TUNNEL 法檢測細胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 mMWNTs 表征數(shù)、分散及淋巴結(jié)示蹤情況

成品mMWNTs 的相關(guān)指標見下圖;配置成混懸液后，室溫下，分散比較均勻，呈現(xiàn)黑色，四周后有少許分層，輕輕震蕩后后，又分散均勻，超聲分散后可恢復(fù)原狀，外磁場作用下有很好的磁順應(yīng)性，SD 鼠足墊注射用，各站淋巴結(jié)黑染示蹤效果好。全身心、肝、腎、肺病理HE 未見碳納米管。而且對5 -FU 有好的載附效果。

表1 紫外分光光度法測定mMWNTs 載附5 -FU 劑量

圖1 mMWNTs 表征數(shù)、分散及淋巴結(jié)示蹤情況

2.2 mMWNTs、mMWNTs-5-FU 對體外SW480 細胞的抑制作用

將mMWNTs(3 mg/ml)、mMWNTs - 5 - FU(3 mg/ml - 12 mg/ml)、5-FU(12 mg/ml)稀釋到不同倍數(shù)，發(fā)現(xiàn)mMWNTs 的濃度高達3 mg/ml 與0.0003 mg/ml 時，對胃癌SGC7901 細胞的殺傷都不明顯，但與含有5 -FU 的兩組相比，其殺傷力明顯較低，細胞抑制率明顯較低(p ＜0.05)。含有5 -FU 兩組對細胞的抑制率與5 -FU 有關(guān)，但mMWNTs-5 -FU 組殺傷效應(yīng)強于5 -FU組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(p ＞0.05)。

圖2 各組藥物對胃癌SGC7901 細胞的抑制率

2.3 mMWNTs、mMWNTs-5-FU 體內(nèi)研究

裸鼠胃癌淋巴結(jié)模型成瘤率為90%，胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)經(jīng)病理HE 證實，給藥前及給藥后三周小鼠的體重和腫瘤體積變化見表4 -1 所示，結(jié)果顯示給藥前和給藥后各組間小鼠體重變化差異不大。C、D 及E 組與A、B 兩組之間比較治療后腫瘤體積的變化，C、D 及E 腫瘤體積明顯有減小，但四組間腫瘤體積減少無明顯差別。第21 天摘取左側(cè)腘窩淋巴結(jié)，計算質(zhì)量和體積抑制率，兩者成線性相關(guān)，R2=0.864，B 組淋巴結(jié)質(zhì)量和體積較A 組明顯增高(p ＜0.05)，E 組淋巴結(jié)質(zhì)量和體積較A 組明顯降低(p ＜0.05)，與C 組比較淋巴結(jié)質(zhì)量和體積也明顯降低(p ＜0.05)。5 -FU組小鼠的白細胞低于正常范圍，與D 及E 組比較差異有顯著意義(p ＜0.05)。

表2 各化療組AI 及IHC 陽性指數(shù)(平均值±標準差)

表3 淋巴結(jié)藥物濃度(平均值±標準差)單位(ug/g)

3 討論

磁性碳納米管混懸液具有一定的穩(wěn)定性，與超聲震蕩時間有關(guān)，4 小時為最佳時間，而且在外磁場下有很好的磁順應(yīng)性，對5-FU有很好的緩釋作用。這在既往研究中［1］得以證實，混懸液注射鼠足墊后，相應(yīng)三站引流淋巴結(jié)有很好的黑染示蹤效果，局部皮膚不會發(fā)生紅腫、潰爛及壞死等情況，碳納米管主要經(jīng)腎臟代謝，未發(fā)現(xiàn)重要臟器聚集及病理反應(yīng)，磁性碳納米管濃度高低對細胞的抑制無差別，而且抑制率很低，都顯示磁性碳納米管磁靶向藥物載體的低毒性。行為、食欲和精神上無明顯異常。說明這種載體無抗原性、對機體的刺激小和與生物體的相容性也比較好。既往LAM 等［2-3］也證明小鼠體內(nèi)無明顯的毒害作用。但也有研究［4-5］對其毒性尚持懷疑態(tài)度。

從體外實驗結(jié)果分析，磁性多壁碳納米管對胃癌SGC7901細胞的殺傷效應(yīng)不明顯，這與一些文獻的報道類似［6-7］。含相同濃度載附在磁性多壁碳納米管的5 -FU 與未載附在磁性多壁碳納米管的5-FU 對胃癌SGC7901 細胞的殺傷效應(yīng)相似，但是他們對細胞的抑制率與阿霉素的濃度呈正相關(guān)。這兩者所含的5-FU旳濃度越大，其細胞的抑制率越大，這表明在體外，真正對SGC7901 細胞起殺傷作用的是5 - FU，并且與其有量效依賴關(guān)系。有學(xué)者研究提示這與磁性碳納米管的穿透性對5 -FU 的協(xié)助作用有關(guān)［8-9］。

建立的足墊原發(fā)瘤+三站淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，成瘤率90%。在此基礎(chǔ)上研究以上靶向藥物，對于治療前后腫瘤體積的變化，C、D、E 組與A、B 組相比有統(tǒng)計學(xué)意義，C、D、E 組腫瘤體積減小比較明顯，但這四組間腫瘤體積減少無明顯差異。研究表明磁性碳納米管可以作為淋巴靶向化療載體，對化療藥物有相應(yīng)的控釋效應(yīng)，對胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用。YANG［10］和LU［11］均撰文磁性碳納米管載附吉西他濱和阿霉素對淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移有抑制作用。靶向化療后重要臟器病理HE 提示未見藥物載體沉積，抽血相關(guān)檢查未見異常，說明磁性多壁碳納米管作為藥物的載體可以減少化療藥物進入血液循環(huán)，從而降低全身不良反應(yīng)。但也有個別持相反觀點的報道毒［12-13］。透射電鏡提示其能載附化療藥物進入細胞，可定位于胞漿空泡［14］。而細胞對顆粒的攝入導(dǎo)致細胞內(nèi)活性氧的升高(Reactive Oxygen Species，ROS)，進而攻擊細胞膜，損傷DNA，導(dǎo)致細胞凋亡［15］?？傊判蕴技{米管作為新型的化療藥物載體的應(yīng)用前景通過本實驗得到進一步證實［16］。

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