鐘 成，劉 淼，李 晶，韓培培，譚之磊，賈士儒

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinus)的靜置培養(yǎng)過程中，在氣液界面處生成細(xì)菌纖維素膜，這一現(xiàn)象被認(rèn)為是木葡糖酸醋桿菌的趨氧性造成的[1].此外，李晶等[2]研究表明，木葡糖酸醋桿菌對氨基酸、碳源、酸和重金屬等都有一定程度的趨化性.Sano 等[3]通過在水中外加電場，利用電解的作用產(chǎn)生氧氣，誘導(dǎo)好氧性的木醋桿菌有序運(yùn)動，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌纖維素的有序纖維結(jié)構(gòu).然而，目前研究者對微生物的趨化過程和鞭毛驅(qū)動蛋白的作用機(jī)理尚不明確.

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是由238 個氨基酸組成的單體蛋白，其相對分子質(zhì)量約為2,688.GFP 最初是由Shimomure[4]從多管水母屬(Aequorea victoria)中分離出來的，以其良好的物理特性和熒光特性，而成為良好的報告基因和熒光標(biāo)記分子，并在探索生命現(xiàn)象過程中得到了非常廣泛的應(yīng)用[5]，可用于活細(xì)胞中直接觀察細(xì)胞運(yùn)動.本文通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pMV24-gfp+，并在木葡糖酸醋桿菌中進(jìn)行表達(dá)，證明其可作為選擇標(biāo)記用于今后的研究.開展GFP 相關(guān)的信號傳導(dǎo)研究，可為研究木葡糖酸醋桿菌生物合成細(xì)菌纖維素與趨化性之間的關(guān)系提供重要的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinus)CGMCC 2955 由工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選，中國普通微生物菌種保藏管理中心(China general microbiological culture collection center，CGMCC)保藏.大腸桿菌(E.,coli)DH5α 由工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏.

pMV24 穿梭載體由日本Mitsukan 集團(tuán)有限公司贈予.

木葡糖酸醋桿菌培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖25，酵母粉7.5，蛋白胨10，Na2HPO410，初始pH 6.0.固體培養(yǎng)基加2%瓊脂.121,℃滅菌15,min.

LB 培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，pH 7.0.固體培養(yǎng)基加 2%瓊脂.121,℃滅菌15,min.

1.1.2 試劑與儀器

蛋白酶K，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；溶菌酶、引物、Taq DNA 聚合酶、dNTPs，上海生工生物工程有限公司；DNA Marker、pCR2.1,T-Vector、DNA柱回收試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒，大連寶生物科技(北京)有限公司；RNase A，美國Genview 公司；限制性內(nèi)切酶，F(xiàn)ermentas 公司.

電熱恒溫水浴鍋，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；臺式高速離心機(jī)，上海醫(yī)用分析儀器廠；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一儀器廠；基因擴(kuò)增儀、凝膠分析儀、Micro pulser 型電轉(zhuǎn)化儀，美國Bio-Rad 公司；熒光顯微鏡、BX51 型熒光顯微鏡，日本Olympus 公司.

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

設(shè)計引物分別在上游和下游加上 EcoRⅠ和XbaⅠ的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)保護(hù)堿基.F：5′-CGGAATT CAAGAAGATATACATATGGCT-3′；R：5′-CTCTAGA CTCGAATTCATTATTTGTAG-3′.下劃線為酶切位點(diǎn).

1.2.2 轉(zhuǎn)基因木葡糖酸醋桿菌CGMCC,2955/pMV24-gfp+的構(gòu)建

以質(zhì)粒pMUTIN-gfp+為模板擴(kuò)增gfp 基因.PCR體系為25,μL 反應(yīng)程序：95,℃模板預(yù)變性5,min；95,℃模板變性30,s，50,℃引物退火30,s，72,℃引物延伸1,min，共33 個循環(huán)；最后72,℃延伸10,min.PCR 產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析.

取出后純化PCR 產(chǎn)物.PCR 產(chǎn)物片段與表達(dá)載體pMV24 用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切.酶切后的gfp基因與pMV24 按3∶1 和5∶1 體系連接，得到重組質(zhì)粒pMV24-gfp+.質(zhì)粒構(gòu)建流程如圖1 所示.將重組質(zhì)?；D(zhuǎn)入E.,coli DH5α (方法見1.2.3)，陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取并測序.將同源性最高(100%)的重組質(zhì)粒命名為pMV24-gfp+.

提取pMV24-gfp+質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)入木葡糖酸醋桿菌CGMCC 2955 感受態(tài)細(xì)胞(方法見1.2.4).隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證并測序.驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子命名為CGMCC 2955/pMV24-gfp+.

圖1 質(zhì)粒構(gòu)建流程圖Fig.1 Construction of pMV24-gfp+ plasmid

1.2.3 化學(xué)轉(zhuǎn)化

于感受態(tài)細(xì)菌中加入5.0,μL 連接產(chǎn)物，輕輕攪拌混勻，冰浴30,min；42,℃水浴熱激90,s，冰浴2,min；每管加LB 液體培養(yǎng)液900,μL，37,℃水浴60,min，180,r/min 振蕩培養(yǎng)1,h；將上述菌液按原倍和稀釋10倍分別涂布于含100,μg/mL 氨芐青霉素100,μL 和40,μg/mL 的X-Gal 的LB 平板，置于37,℃培養(yǎng)箱，37,℃正放至涂布液體基本被吸收，再倒置培養(yǎng)18～24,h.從平板上挑取單個分離良好的白色菌落.

1.2.4 木葡糖酸醋桿菌電轉(zhuǎn)化

取甘油管中保存的木葡糖酸醋桿菌的菌液接入裝有100,mL 液體培養(yǎng)基的500,mL 搖瓶中，30,℃、160,r/min 振蕩培養(yǎng)24,h，向液體搖瓶中加入1,mL 纖維素酶(10,000,U/mL)，30,℃酶解2,h.酶解后離心洗滌后的細(xì)胞，經(jīng)10%甘油-氯化鎂溶液洗滌、離心各2次，再以10%甘油懸浮、離心各2 次，最后用10%甘油溶液懸浮制成感受態(tài)細(xì)胞.電擊條件為：電壓2.40,kV、電容25,μF、電阻200,Ω.在含氨芐青霉素100,μg/mL 的抗性固體平板上篩選轉(zhuǎn)化子.

1.2.5 轉(zhuǎn)基因芽的GFP 熒光觀察

在BX51 型熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞中GFP 熒光的表達(dá)情況，采用自動成像系統(tǒng)拍照.

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增結(jié)果與克隆載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒pMUTIN-gfp+為模板擴(kuò)增gfp 基因，擴(kuò)增的片段與表達(dá)載體pMV24 用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，結(jié)果如圖2 所示.從電泳結(jié)果看，在PCR 擴(kuò)增的gfp 基因與預(yù)期大小相符.經(jīng)切膠回收，連接pCR2.1 T 載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α.陽性克隆測序結(jié)果分析顯示gfp 基因片段與pMUTIN-gfp+的目的片段序列大小(717,bp)一致，二者的堿基序列相同.

圖2 目的基因和穿梭質(zhì)粒的雙酶切電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of target gene and shuttle plasmid with restriction enzyme digestion

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切處理后的pCR2.1,T/gfp+質(zhì)粒，通過瓊脂糖凝膠電泳分離T 載體片段和gfp 目的片段，將gfp 基因回收后，與pMV24 按3∶1和5∶1 體系分別過夜連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中.挑取綠色菌落，提取質(zhì)粒并采用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖3 所示.由圖3(b)可以看出，在4,000,bp 和750,bp 的DNA Marker 條帶附近有與預(yù)期大小抑制的條帶出現(xiàn).

圖3 gfp+轉(zhuǎn)化子的鑒定Fig.3 Identification of gfp+ transformation

2.3 GFP在G.xylinus CGMCC 2955中的表達(dá)

將構(gòu)建好的質(zhì)粒pMV24-gfp+電轉(zhuǎn)化至木葡糖酸醋桿菌中.將轉(zhuǎn)化菌株置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4 所示.轉(zhuǎn)化菌株在熒光顯微鏡的藍(lán)色激發(fā)光下可發(fā)出綠色熒光，拍照可觀察到菌體發(fā)出綠色的熒光，說明重組質(zhì)粒pMV24-gfp+在木葡糖酸醋桿菌中表達(dá)，證明其可作為選擇標(biāo)記用于今后木葡糖酸醋桿菌的趨化性研究.

圖4 轉(zhuǎn)化子熒光顯微照片F(xiàn)ig.4 Fluorescence micrograph of transformant

3 討論

作為一種報告基因，GFP 比lacZ、CAT 等報告基因有許多無可比擬的優(yōu)越性：GFP 不具有種屬依賴性，在多種原核和真核生物細(xì)胞中都表達(dá)；不需要反應(yīng)底物與其他輔助因子，在藍(lán)光的激發(fā)下可產(chǎn)生綠色熒光；通過替換特性氨基酸，可產(chǎn)生不同顏色的光，滿足不同的研究需求等[6].因而，GFP 可廣泛應(yīng)用于報告基因、基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞的分離與純化等領(lǐng)域[7]，可在更接近自然真實(shí)狀態(tài)的條件下進(jìn)行活細(xì)胞實(shí)時定位觀察.如在活細(xì)胞中直接觀察蛋白質(zhì)向細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)動的狀態(tài)，還可實(shí)時觀察到外界信號刺激下目的蛋白的變化過程.

然而，蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時，常常受到目的基因本身結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控和蛋白質(zhì)折疊等諸多因素的影響.目的基因在原核表達(dá)系統(tǒng)的有效表達(dá)成為基因工程技術(shù)的難點(diǎn)之一，制約了蛋白質(zhì)的功能研究和應(yīng)用.本文所采用的穿梭質(zhì)粒pMV24 是由日本Mizknan Holdings 中央研究院構(gòu)建而成，目前已廣泛用作醋酸菌屬的穿梭質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒[8].Fukay等[8]使用pMV24 穿梭質(zhì)粒研究Acetobacter polyoxogenes 中乙醛脫氫酶對醋酸產(chǎn)量的影響.本文也成功使用該質(zhì)粒使GFP 蛋白在木葡糖酸醋桿菌中表達(dá).此外，pMV24 質(zhì)粒中的氨芐青霉素抗性篩選基因也正是木葡糖酸醋桿菌所缺失的.因而，陽性克隆細(xì)胞的篩選簡便、成功率高.

目前，由于木葡糖酸醋桿菌的定向運(yùn)動可直接引起細(xì)菌纖維素的規(guī)則性排列，使得木葡糖酸醋桿菌的趨化性廣泛受到研究者的關(guān)注.孫臻[9]利用熒光染料coriphosphine O 對木醋桿菌(Acetobacter xylinus)進(jìn)行染色，以觀察微生物細(xì)胞在單根條紋管道和網(wǎng)格狀微流控芯片中的運(yùn)動.然而，其染色過程通常伴隨著對菌體的離心和洗滌等多個處理程序，往往造成微生物細(xì)胞的損傷.而GFP 無毒性且是菌體在不受任何外界環(huán)境影響的前提下自發(fā)表達(dá)的，可在最自然的狀態(tài)下追蹤細(xì)胞的運(yùn)動.或者，將GFP 與其他蛋白融合追蹤蛋白的變化過程.Englert 等[10]就曾用表達(dá)綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的大腸桿菌對趨化性進(jìn)行了定量分析.Sourjik 等[11-12]用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)研究了趨化信號傳導(dǎo)系統(tǒng)中各種蛋白的相互作用.

綜上所述，將GFP 基因在木葡糖酸醋桿菌中成功表達(dá)是追蹤菌體細(xì)胞運(yùn)動和胞內(nèi)蛋白遷移的最佳選擇，還可用于檢測基因表達(dá)的時序性，例如觀察使木葡糖酸醋桿菌具有趨化反應(yīng)的鞭毛及其動力蛋白等分子發(fā)動機(jī)的形成.因此，本實(shí)驗(yàn)采用PCR 技術(shù)擴(kuò)增出綠色熒光蛋白，以pMV24 穿梭質(zhì)粒為載體，實(shí)現(xiàn)了GFP 綠色熒光蛋白基因在木葡糖酸醋桿菌中的表達(dá)；在熒光顯微鏡的藍(lán)色激發(fā)光下可觀察到綠色熒光；此轉(zhuǎn)化子的成功構(gòu)建為木葡糖酸醋桿菌趨化性的深入研究奠定了堅實(shí)的研究基礎(chǔ).

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