廖月霞，孔桂美，陶文華，卜 平

揚州大學醫(yī)學院中西醫(yī)結合腫瘤防治實驗室，揚州 225001

芹菜素(4＇，5，7-三羥基黃酮，Apigenin)是一種天然植物黃酮，廣泛存在于蔬菜、水果、豆類、中草藥、紅酒和啤酒中，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等黃酮類生物活性［1，2］。流行病學研究結果顯示飲食中富含芹菜素可以降低腸癌、卵巢癌、肺癌等腫瘤發(fā)生的風險［3］。一些研究結果提示芹菜素能通過誘導腫瘤細胞凋亡而抑制腫瘤細胞生長［4，5］。Munyendo等［6］應用磷脂混合膠技術研究芹菜素抗腫瘤活性，結果顯示口服芹菜素混合膠可明顯提高芹菜素對S180移植瘤抑瘤活性。此外，芹菜素具有抑制免疫細胞生長，誘導細胞周期阻滯，促進細胞凋亡作用，具有潛在的調控肥大細胞介導的炎癥反應活性和抑制臍靜脈內皮細胞表達IL-6、IL-8、ICAM-1 等炎癥因子活性［7-9］。對其機制研究結果顯示芹菜素可以通過對相應基因和蛋白的抑制或激活，調節(jié)信號分子，干預酶作用等途徑調節(jié)細胞周期與凋亡、抑制侵襲與遷移、抑制血管新生、調節(jié)免疫等機制發(fā)揮生物性活性［10］。本實驗應用不同濃度芹菜素作用于正常小鼠脾細胞和小鼠S180肉瘤細胞，觀察其對不同細胞增殖的調節(jié)作用，以期為合理開發(fā)利用芹菜素提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

MTT、硫酸亞鐵、水楊酸，DPPH［2，2-di(4-tertoctylphenyl)-1-picrylhydrazyl］、碘化丙啶(PI)為Sigma 公司產(chǎn)品，芹菜素(apigenin，HPLC ＞98%)為南京替斯艾么中藥技術研究所產(chǎn)品，活性氧檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司，RPMI 1640 購自Gibco 公司，其他實際均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.2 主要儀器

多功能酶標儀(Biotek，USA)，SUV-2120 分光光度儀(SCINCO，韓國)，分析型流式細胞儀(BD FACSCalibur，USA)，倒置熒光顯微鏡(Nikon，日本)。

1.1.3 細胞及動物

小鼠S180肉瘤細胞購自中國科學院上海細胞庫;4～6 周齡SPF 級ICR 小鼠購自江蘇省比較醫(yī)學中心(合格證No:2023469)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

1.2.1.1 小鼠S180肉瘤細胞

S180細胞培養(yǎng)于完全RPMI 1640 培養(yǎng)基(含10% FBS，100 IU/mL 青霉素和鏈霉素100 (g/mL)，取對數(shù)生長期S180細胞，調整細胞濃度為5 ×104/mL。

1.2.1.2 小鼠脾細胞

4～6 周SPF 級ICR 小鼠脫頸處死，75%乙醇浸泡10 min，無菌操作取鼠脾臟，放在裝有預冷PBS的平皿中漂洗去血漬剔除外膜。用PBS 溶液沖洗兩遍，輕柔碾碎，200 目金屬細胞濾網(wǎng)過濾，收集細胞懸液，加入紅細胞裂解液，靜置5 min 后，用PBS溶液洗滌3 次，調整細胞濃度5 ×105/mL。

1.2.2 MTT 檢測細胞增殖情況

將與不同濃度芹菜素孵育細胞培養(yǎng)48 h 后，每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)工作液，37 °C，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)4 h，離心去上清，每孔加入100 μL DMSO，于振蕩器上震蕩10 min，檢測吸光度，并計算細胞增殖率。細胞增殖抑制率=1-(實驗孔A均值-空白孔A 均值)/(溶媒空均值-空白孔A 均值)×100%。每組實驗設平行6 復孔，重復3 次。

1.2.3 PI 單染測細胞凋亡

同上細胞濃度種板，以5%血清培養(yǎng)基重懸細胞，24 h 后收集細胞。以PBS 重懸細胞，加入-20 °C預冷的75%乙醇中固定。4 °C 過夜后PBS 重懸細胞5 min。200 目篩網(wǎng)收集細胞。加入1mL PI 染色液(50 μg/mL)，4 °C、避光孵育45 min。流式細胞儀分析PI 熒光Sub-G1細胞百分率，實驗重復3 次。

1.2.4 細胞內活性氧濃度測定

應用不同濃度芹菜素(12.5、25、50、100 μmol/L)刺激S180細胞和脾細胞24 h，調整S180細胞濃度為2 ×106/mL，脾細胞濃度5 ×107/mL，參考文獻［11］實驗方法，應用碧云天活性氧檢測試劑盒，步驟簡述如下:按照1∶1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。細胞收集后懸浮于稀釋好的37 °C DCFH-DA 中45 min。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，ROS 陽性對照或不同濃度芹菜素(12.5、25、50、100 μmol/L)刺激細胞30 min。收集細胞后流失細胞儀檢測，使用488 nm 激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，檢測刺激前后熒光的強弱，實驗重復3次。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

2 實驗結果

2.1 芹菜素素對細胞活力的影響

MTT 實驗結果顯示，芹菜素素對正常ICR 小鼠來源的脾細胞具有明顯抑制細胞增殖作用，與溶媒對照組比較，25 μmol/L 芹菜素可抑制60%左右的細胞增殖，IC50約為20 μmol/L。對小鼠S180肉瘤細胞也具有明顯抑制細胞增殖作用，IC50約為50 μmol/L。結果提示芹菜素素對不同細胞增殖作用可能沒有特異性(圖1)。

圖1 芹菜素抑制小鼠來源脾細胞(A)及S180細胞(B)增殖(*，P＜0.05;＊＊，P＜0.01)Fig.1 Apigenin inhibited the proliferation of mice spleen cells (A)and S180cells (B)(*，P＜0.05;＊＊，P＜0.01)

2.2 芹菜素對細胞凋亡的影響

為進一步研究芹菜素對不同細胞的作用，對芹菜素作用24 h 后的細胞進行單染分析，結果顯示＞25 μmol/L 芹菜素作用的小鼠來源的脾細胞組Sub-G1期細胞比例明顯增加(P＜0.05)，提示芹菜素可能通過促進小鼠脾細胞凋亡抑制其細胞增殖(圖2)。對S180細胞作用結果也顯示＞25 μmol/L 芹菜素作用的S180細胞組Sub-G1期細胞比例明顯增加(P＜0.05)，提示芹菜素可能也是通過促進小鼠脾細胞凋亡抑制其細胞增殖(圖3)。這些結果提示芹菜素可能非特異性地誘導不同細胞發(fā)生凋亡。

圖2 芹菜素誘導小鼠來源脾細胞凋亡(*，P＜0.05;＊＊，P＜0.01)Fig.2 Apigenin induced the mice spleen cell apoptosis (*，P＜0.05;＊＊，P＜0.01)

圖3 芹菜素誘導S180肉瘤細胞凋亡(*，P＜0.05)Fig.3 Apigenin induced the S180cell apoptosis (*，P＜0.05)

2.3 芹菜素素對不同細胞內活性氧作用

實驗結果顯示芹菜素在較低濃度時即明顯升高ICR 小鼠來源脾細胞內活性氧產(chǎn)生，在量效關系上呈現(xiàn)低濃度上升，較高濃度下降的特點，且對脾細胞不同細胞群細胞內活性氧均有增加作用(圖4)。圖5 結果顯示芹菜素顯著促進S180小鼠肉瘤細胞內活性氧產(chǎn)生，在量效關系上也呈現(xiàn)低濃度上升，較高濃度下降的特點，這些結果提示芹菜素素對不同細胞內活性氧產(chǎn)生也存在非特異性調節(jié)作用，且較低濃度即明顯促進細胞內活性氧生成，推測其在較高濃度的下降趨勢可能與細胞凋亡增加有關。

3 討論

圖4 芹菜素升高了脾細胞內活性氧水平(*，P＜0.05;＊＊，P＜0.01)Fig.4 Apigenin increased the level of intercellular ROS of mice spleen cells (*，P＜0.05;＊＊，P＜0.01)

圖5 芹菜素升高了S180細胞內活性氧水平(＊＊，P＜0.01)Fig.5 Apigenin increased the level of intercellular ROS of S180cells (＊＊，P＜0.01)

本節(jié)研究結果顯示芹菜素顯著抑制了小鼠脾細胞和S180細胞增殖并誘導其凋亡，同時，芹菜素顯著升高細胞內活性氧水平。這些結果提示芹菜素可能是通過升高細胞內活性氧水平，誘導不同細胞發(fā)生凋亡。

藥物或毒物抑制細胞增殖通常通過阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡和促進細胞壞死等途徑［12］，本次實驗中，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡變化，結果顯示芹菜素、顯著誘導S180細胞和脾細胞發(fā)生凋亡，隨著濃度的增加，細胞凋亡率逐漸增加。這些結果提示芹菜素可能通過促進S180細胞和脾細胞凋亡從而抑制細胞增殖。

由超氧離子、過氧化氫和羥自由基組成的活性氧是細胞代謝的副產(chǎn)品，在細胞增殖、分化和凋亡中具有調控作用［13］。研究證實，細胞內氧化和抗氧化基本處于平衡狀態(tài)，當?shù)臀⑺降幕钚匝跎呖纱龠M細胞增殖，而較高水平的活性氧則引發(fā)細胞凋亡，更高水平的活性氧則直接導致細胞壞死［14］。本次實驗結果顯示芹菜素明顯升高了S180細胞和脾細胞內活性氧水平，這與文獻［14］報道結論基本一致，提示芹菜素可能是通過升高細胞內活性氧水平，進一步影響活性氧下游的細胞信號系統(tǒng)，促進了S180細胞和脾細胞的凋亡。

脾臟是體內最大的外周免疫器官，在機體免疫，尤其抗腫瘤免疫方面占有十分重要的地位，脾臟富含大量的免疫細胞和免疫因子參與腫瘤免疫，如淋巴細胞、巨噬細胞、DC 細胞和調理素、補體等，通過不同的機制參與免疫反應，發(fā)揮免疫功能［15］。脾臟功能在腫瘤的不同階段扮演不同的角色，具有雙向性、時向性特點，有實驗證實，脾臟切除對大鼠腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和擴散有顯著的促進作用［16］。本實驗結果顯示芹菜素同時抑制脾細胞和S180腫瘤細胞增殖，提示其作用可能具有非特異性，這種非特異性作用在芹菜素抗腫瘤機制的意義和作用有待進一步研究。

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