張露勇 ，羅菲亞，胡培麗，單 純，李 銳(.中國(guó)食品藥品檢定研究院食品化妝品所，北京 00050;2.中日友好醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 00029)

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，來(lái)源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，起源于神經(jīng)外胚層。膠質(zhì)瘤發(fā)病率高，約占顱內(nèi)腫瘤的35%～61%［1］，且近年來(lái)還有不斷增加的趨勢(shì)［2］。膠質(zhì)瘤呈彌漫性浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與周圍正常腦組織無(wú)明顯界限，難以手術(shù)切除，因而術(shù)后的復(fù)發(fā)率高。以手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)藥物治療等組成的綜合治療體系是目前腦膠質(zhì)瘤治療的主要方法［3］。由于其復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，化療對(duì)于抑制腫瘤的復(fù)發(fā)具有十分重要的作用［4］，但并非所有的患者均可獲得很好的化療效果，化療藥物的耐藥是膠質(zhì)瘤治療失敗的原因之一。因此，克服耐藥性是提高腦膠質(zhì)瘤患者生存率的關(guān)鍵。

DNA 修復(fù)蛋白O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine DNA-methyltransferase，MGMT)基因是常見的針對(duì)烷類化療藥的耐藥基因，它在腦膠質(zhì)瘤組織中的增多與腫瘤耐藥性有關(guān)。MGMT 蛋白是一種DNA 直接修復(fù)酶，能修復(fù)DNA 序列中的O6-甲基鳥嘌呤損傷。但是有研究證實(shí)，如果其DNA 修復(fù)能力增強(qiáng)，腫瘤易感性降低，則對(duì)化療可能存在抵抗作用［5］。MGMT 蛋白的表達(dá)主要受啟動(dòng)子甲基化的調(diào)控，啟動(dòng)子甲基化可以下調(diào)其基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MGMT 蛋白表達(dá)的下降，反之啟動(dòng)子去甲基化則可以增加蛋白的表達(dá)，從而使得腫瘤細(xì)胞對(duì)烷類化療藥產(chǎn)生耐藥性［6］。由此可以提出假設(shè)，若能在化療前檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤的耐藥基因，則能識(shí)別化療有效的人群，從而提高膠質(zhì)瘤的療效。

本研究采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)方法檢測(cè)MGMT 在膠質(zhì)瘤及正常腦組織中的表達(dá);采用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)測(cè)定的方法檢測(cè)MGMT 基因啟動(dòng)子甲基化與MGMT 蛋白表達(dá)的相關(guān)性，系統(tǒng)分析MGMT 與腫瘤惡性程度的關(guān)系，與膠質(zhì)瘤患者的年齡、性別之間的關(guān)系，以期為腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、腫瘤耐藥性機(jī)制及臨床診治提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)收集中日友好醫(yī)院神經(jīng)外科2010 年7 月至2014 年7 月術(shù)中切除的病理診斷為腦膠質(zhì)瘤的石蠟包埋組織標(biāo)本共計(jì)45 例，并按照2007 年WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)(Ⅰ～Ⅳ)，所有病例術(shù)前均未行放化療，也無(wú)身體其他部位的腫瘤。45 例標(biāo)本中，男性25 例，年齡20～71 歲，平均年齡42.48 歲;女性20 例，年齡19～72 歲，平均年齡40.21歲。正常腦組織11 例，均為因腦動(dòng)靜脈畸形行手術(shù)切除的正常腦組織以及腫瘤周圍正常腦組織，作為對(duì)照組。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè):本研究采用S-P 免疫組織化學(xué)染色法對(duì)腦膠質(zhì)瘤組及正常腦組織組進(jìn)行染色，其步驟大致分為石蠟切片的制備、HE 染色及IHC 檢測(cè)。其染色結(jié)果按照Krajewska 法進(jìn)行半定量分析:高倍鏡(×400)下隨機(jī)計(jì)數(shù)5 個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞≤4%為0 分、5%～24%為1 分、25%～49%為2 分、50%～74%為3 分、≥75%為4 分;染色強(qiáng)度:無(wú)色為0 分、1～4 分為弱陽(yáng)性(+)、5～8 分為中等陽(yáng)性(+ +)、9～12 分為強(qiáng)陽(yáng)性(+ + +)。

1.2.2 甲基化特異性PCR(MSP)測(cè)定: 其步驟大致分為DNA 的提取、DNA 亞硫酸氫鈉的修飾及甲基化特異性PCR。其結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為:MGMT 甲基化基因(MGMT methylation gene，MGMT-M)表達(dá)陽(yáng)性或MGMT-M 和MGMT 去甲基化基因(MGMT demethylation gene，MGMT-D)同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性為甲基化;MGMT-D 表達(dá)陽(yáng)性為去甲基化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，采取χ2檢驗(yàn)分析的方法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MGMT 在腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達(dá)情況

45 例腦膠質(zhì)瘤中20 例MGMT 蛋白表達(dá)為陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為44.44%(20/45)，而11 例腦動(dòng)靜脈畸形腦組織中只有1 例MGMT 的表達(dá)為陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為9.09%(1/11)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，二者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.714，P=0.030，即P＜0.05)。

2.2 MGMT 在不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況

MGMT 在不同級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤中均有表達(dá)，具體表達(dá)情況如下:Ⅰ級(jí)陽(yáng)性率為57.14%(4/7)，Ⅱ級(jí)陽(yáng)性率為40.00%(4/10)，Ⅲ級(jí)陽(yáng)性率為43.75% (7/16)，Ⅳ級(jí)陽(yáng)性率為50.00%(6/12)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，不同級(jí)別膠質(zhì)瘤之間的MGMT 表 達(dá) 差 異 無(wú) 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義(χ2= 0.596，P= 0.897 ＞0.05)。

2.3 腦膠質(zhì)瘤組織中MGMT 的表達(dá)與性別及年齡的相關(guān)性

MGMT 在男性中表達(dá)陽(yáng)性率為56.00%(14/25)，在女性中表達(dá)陽(yáng)性率為45.00%(9/20)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析男、女性別組間MGMT 表達(dá)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.538，P=0.463，即P＞0.05);MGMT 在≥40 歲年齡組中表達(dá)陽(yáng)性率為54.17%(13/24)，在＜40 歲年齡組中表達(dá)陽(yáng)性率為47.62%(10/21)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上述不同年齡組間MGMT 表達(dá)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.192，P=0.661 ＞0.05)。

2.4 MGMT 基因啟動(dòng)子甲基化與蛋白表達(dá)的相關(guān)性

MGMT 基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率為57.78%(26/45)，其中蛋白表達(dá)陽(yáng)性組中，甲基化的發(fā)生率為38.89%(7/18)，蛋白表達(dá)陰性組中，甲基化的發(fā)生率為70.37%(19/27)，2 組比較，MGMT 基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.388，P=0.036 ＜0.05)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，MGMT 蛋白表達(dá)與MGMT 基因啟動(dòng)子甲基化存在負(fù)相關(guān)，見表1。

表1 MGMT 基因啟動(dòng)子甲基化與蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析Tab 1 Correlation of MGMT gene promoter methylation with protein expression

2.5 不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中MGMT 基因啟動(dòng)子甲基化的表達(dá)

腦膠質(zhì)瘤MGMT 基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率及不同腫瘤級(jí)別甲基化陽(yáng)性率見表2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，不同級(jí)別膠質(zhì)瘤之間的MGMT 基因啟動(dòng)子甲基化的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.277，P=0.153 ＞0.05)。

3 討論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，來(lái)源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，具有高度侵襲性，呈彌漫性浸潤(rùn)生長(zhǎng)，約占顱內(nèi)腫瘤的50%～60%，國(guó)內(nèi)報(bào)道占原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的40%［7］。世界衛(wèi)生組織2007 年根據(jù)腫瘤的組織學(xué)及病理學(xué)因素將腫瘤分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，低級(jí)別膠質(zhì)瘤的治療方法以手術(shù)切除為主，術(shù)后輔以放療。高級(jí)別膠質(zhì)瘤手術(shù)切除后容易復(fù)發(fā)，且難以大范圍地切除，對(duì)射線的敏感性低，普通化療藥物也難以通過(guò)血腦屏障。即使聯(lián)合治療，其中未復(fù)發(fā)時(shí)間也僅有21 個(gè)月［8］?；熓菒盒阅z質(zhì)瘤常規(guī)治療手段之一，在延長(zhǎng)患者的生存方面有十分重要的作用。替莫唑胺是第2 代烷化劑，目前被作為膠質(zhì)瘤化療的一線用藥。其作用靶點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞的DNA 上，當(dāng)腫瘤細(xì)胞的DNA 修復(fù)能力增強(qiáng)時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，耐藥性的產(chǎn)生限制了烷化劑的臨床應(yīng)用，所有膠質(zhì)瘤化療效果不佳的根本原因是腫瘤耐藥［9］。MGMT 是DNA修復(fù)基因中的一部分，其在體內(nèi)是否表達(dá)及表達(dá)的強(qiáng)度影響著療效，而MGMT 蛋白的表達(dá)強(qiáng)度又與MGMT 啟動(dòng)子甲基化有關(guān)［10］。本研究通過(guò)檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織中MGMT 的表達(dá)情況，為腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和耐藥機(jī)制提供依據(jù)，為腫瘤患者個(gè)體化治療選擇合理的方案提供參考。

表2 不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中MGMT 基因啟動(dòng)子甲基化的表達(dá)Tab 2 MGMT gene promoter methylation expression in different grade of gliomas

MGMT 蛋白是一種高效的DNA 直接修復(fù)酶，能修復(fù)DNA序列中的O6-甲基鳥嘌呤，正常組織中有一定水平的MGMT 表達(dá)，其存在可抑制突變的發(fā)生和原癌基因的活化，是機(jī)體抵抗烷化劑損傷的主要因素［11］。MGMT 既是抗癌基因又是耐藥基因，如果其DNA 修復(fù)能力增強(qiáng)，腫瘤易感性降低，則對(duì)化療可能存在抵抗作用。在本研究中，11 例正常腦組織中有1 例MGMT 表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為9.09%。45 例腦膠質(zhì)瘤中有20 例MGMT 蛋白有陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為44.44%，顯著高于正常腦組織(P＜0.05)。有研究表明，MGMT 在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)與腫瘤耐藥性有一定聯(lián)系，可能影響患者的預(yù)后，MGMT 表達(dá)陰性的患者烷化劑藥物的近期療效和生存時(shí)間明顯優(yōu)于MGMT 表達(dá)陽(yáng)性的患者［12］。

由本研究可以看出，MGMT 在不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤中表達(dá)雖然有所不同，Ⅰ級(jí)陽(yáng)性率為57.14%，Ⅱ級(jí)陽(yáng)性率為40.00%，Ⅲ級(jí)陽(yáng)性率為43.75%，Ⅳ級(jí)陽(yáng)性率為50.00%，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，因此可以粗略得出，MGMT 的表達(dá)與腫瘤的惡性程度之間并無(wú)關(guān)系，這與Esteller 等［13］研究得出的結(jié)論相一致。但是也有學(xué)者認(rèn)為，腦膠質(zhì)瘤MGMT 的表達(dá)與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)［14-15］。造成這些不同結(jié)論的原因可能與免疫組織化學(xué)的檢測(cè)方法、樣本量的多少等因素有關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)尚需大樣本的臨床研究支持。

本研究也分析了性別及年齡的因素與MGMT 表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，MGMT 在男性中表達(dá)陽(yáng)性率為56.00%，在女性中表達(dá)陽(yáng)性率為45.00%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析2 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);MGMT 在≥40 歲年齡組中表達(dá)陽(yáng)性率為54.17%，在＜40 歲年齡組中表達(dá)陽(yáng)性率為47.62%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析2 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。這與Esteller M等［16］報(bào)道的結(jié)果相一致。因此本組認(rèn)為，臨床上為腦膠質(zhì)瘤患者制訂個(gè)體化化療方案時(shí)，性別及年齡不能作為單獨(dú)的參考因素。

有研究指出，MGMT 基因啟動(dòng)子去甲基化會(huì)導(dǎo)致MGMT 蛋白表達(dá)的增加，這是烷化劑耐藥的主要原因。由此可以推斷出，基因啟動(dòng)子甲基化的檢測(cè)可能成為預(yù)測(cè)腫瘤對(duì)烷化劑化療藥敏感性的標(biāo)志［17］。本研究的45 例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，18 例MGMT 蛋白表達(dá)陽(yáng)性，其中甲基化的7 例;27 例MGMT 蛋白表達(dá)陽(yáng)性，其中甲基化的19 例。MGMT 蛋白表達(dá)與MGMT 基因啟動(dòng)子甲基化存在負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。MGMT 基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率為57.78%，且不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中甲基化的表達(dá)無(wú)明顯差異(P＜0.05)。有研究報(bào)道［18］腦膠質(zhì)瘤組織與血清中MGMT 基因啟動(dòng)子甲基化的情況具有一致性，因此測(cè)量血清中MGMT 基因啟動(dòng)子甲基化的情況，既可以避免穿刺活檢的有創(chuàng)風(fēng)險(xiǎn)，又可以達(dá)到對(duì)腫瘤早期診斷的目的。

腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織中MGMT 的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MGMT 在不同膠質(zhì)瘤中的表達(dá)不同，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明MGMT 的表達(dá)與腫瘤的惡性程度無(wú)相關(guān)性，但與烷化劑耐藥有關(guān)。MGMT 在性別及年齡之間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故臨床上為患者制訂個(gè)性化治療方案時(shí)，不能單獨(dú)考慮性別、年齡的因素。MGMT 基因啟動(dòng)子甲基化與MGMT的表達(dá)關(guān)系密切，使用烷化劑化療前測(cè)定腫瘤細(xì)胞的MGMT活性具有一定的指導(dǎo)意義。

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