王超莉，張智俊，屈亞平，王 蕾

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300）

毛竹丙酮酸磷酸雙激酶調(diào)節(jié)蛋白基因克隆、原核表達(dá)及純化

王超莉，張智俊，屈亞平，王 蕾

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300）

丙酮酸磷酸雙激酶調(diào)節(jié)蛋白（pyruvate,orthophosphate dikinase regulatory proteins,RP）是通過(guò)調(diào)控丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate,orthophosphate dikinase，PPDK）參與C4途徑光合碳循環(huán)途徑。毛竹Phyllostachys edulis作為一種重要的經(jīng)濟(jì)竹種，分析克隆RP基因?qū)τ谥耦愔参锕夂献饔玫难芯烤哂兄卮罄碚摵蛻?yīng)用價(jià)值。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）成功克隆得到毛竹PeRP1，該基因cDNA全長(zhǎng)1 275 bp，編碼425個(gè)氨基酸；經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，該蛋白屬于kinase-PPPase超家族，主要含有UDF 299保守結(jié)構(gòu)域；經(jīng)多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)毛竹PeRP1蛋白與C3植物中RP1親緣關(guān)系較近，而與C4植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。為了研究PeRP1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，我們將PeRP1蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，利用Ni-NTA樹(shù)脂親和層析結(jié)合分子篩（SEC）層析的方法純化得到了PeRP1重組蛋白。SEC純化的結(jié)果表明：PeRP1蛋白在溶液中主要以多聚體形式存在，二聚體及單體含量較少，推測(cè)PeRP1蛋白可能以多聚體形式參與調(diào)控PPDK蛋白。這為今后研究該蛋白的結(jié)構(gòu)與功能打下了良好基礎(chǔ)。圖7參15

植物學(xué)；毛竹；丙酮酸磷酸雙激酶調(diào)節(jié)蛋白；基因克??；原核表達(dá)；蛋白純化

生物的一切物質(zhì)和能量都來(lái)源于光合作用，碳4（C4）途徑是光合作用的一個(gè)重要途徑，是決定植物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一。C4途徑是由碳3（C3）途徑進(jìn)化而來(lái)的一種高光效種類。與C3途徑相比，它們具有高光強(qiáng)、高溫及低二氧化碳濃度下保持高光效的能力，C3植物同樣具有C4光合途徑中的酶［1］。丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate,orthophosphate dikinase，PPDK）是C4途徑的限速酶之一，而丙酮酸磷酸雙激酶調(diào)節(jié)蛋白（PPDK-RP或RP）是調(diào)節(jié)丙酮酸磷酸雙激酶活性的關(guān)鍵酶［2］。Burrell等［3］從植物的葉片直接分離得到了RP這個(gè)蛋白，但是分離得到的蛋白量比較少，且很不穩(wěn)定。Burnell和Chastain［4］首次在玉米Zea mays中克隆到了RP基因，在體外獲得高表達(dá)量的蛋白。植物RP蛋白含有一個(gè)長(zhǎng)度為299個(gè)氨基酸殘基的保守結(jié)構(gòu)域UDF299，這個(gè)保守結(jié)構(gòu)域在微生物RP中也存在，植物來(lái)源的UDF299可以調(diào)節(jié)PPDK，微生物來(lái)源的UDF299主要調(diào)節(jié)磷酸烯醇丙酮酸合成酶（phosphoenolpyruvate synthetase，PEPS）［5］。Chastain等［3,5］研究揭示了RP對(duì)PPDK的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，即RP可催化PPDK活性部位色氨酸/蘇氨酸殘基的去磷酸化和磷酸化，從而改變 PPDK酶的活性和非活性狀態(tài)，最終影響植物光合碳循環(huán)。Chastain等［6－7］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)擬南芥Arabidopsis thaliana中RP存在RP1和RP2等2種基因編碼形式，其中RP1定位于細(xì)胞葉綠體，具有蛋白激酶和磷酸酶活性，而RP2主要在細(xì)胞質(zhì)中存在，無(wú)磷酸酶功能，僅具有蛋白激酶功能［6－7］。但迄今為止，由于RP晶體結(jié)構(gòu)尚不清楚，這就造成RP蛋白與PPDK蛋白互作以及不同來(lái)源的RP結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究缺乏結(jié)構(gòu)生物學(xué)的直接證據(jù)。毛竹Phyllostachys edulis是一種重要的經(jīng)濟(jì)竹種。本研究主要克隆毛竹RP1基因和預(yù)測(cè)了RP1基因相關(guān)生物信息學(xué)分析，同時(shí)構(gòu)建高效原核表達(dá)體系，分離純化穩(wěn)定的RP1蛋白，擬為毛竹RP1蛋白的空間結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)功能、竹類植物光合分子機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

材料為取自浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地培養(yǎng)室內(nèi)半年生毛竹幼嫩葉片。

1.2 研究方法

1.2.1 毛竹幼苗RNA的提取和cDNA的合成 取新鮮、無(wú)病蟲(chóng)害竹葉，液氮速凍，研磨成粉末，采用總RNA提取試劑（Trizol）提取試劑盒提取核糖核酸（RNA），利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）。

1.2.2 PeRP1基因的克隆 根據(jù)擬南芥的RP1基因序列，檢索毛竹表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）數(shù)據(jù)庫(kù)，得到一條同源序列，設(shè)計(jì)引物：上游BamHⅠ酶切位點(diǎn)引物F 5′-CGGGTACCATGATAAGCGCCAAG和下游HindⅢ酶切位點(diǎn)引物R 3′-CCCAAGCTTCTAGTACCGTTTTGATATGC（由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）。以毛竹cDNA為模板，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）克隆RP1。

1.2.3 對(duì)目的片段進(jìn)行生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN軟件預(yù)測(cè)RP基因開(kāi)放閱讀框（ORF），RP蛋白等電點(diǎn)、親疏水性，并對(duì)RP1蛋白同源序列進(jìn)行多序列比對(duì)，用Mega 5.0軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析RP1蛋白進(jìn)化關(guān)系。

1.2.4 PeRP1原核表達(dá)載體構(gòu)建 利用BamHⅠ與HindⅢ限制性內(nèi)切酶雙酶切PCR產(chǎn)物，插入到原核表達(dá)載體（pe-SUMO），得到N-末端含有6個(gè)His親和標(biāo)簽的重組子，熱激法將重組子轉(zhuǎn)化到表達(dá)細(xì)胞Escherichia coil（Ril），挑取陽(yáng)性克隆，進(jìn)行雙酶切和單酶切及測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.5 重組PeRP1蛋白的可溶性表達(dá)及純化 從抗氨芐平板上挑取單克隆，接入到600.0 μL的LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，從培養(yǎng)過(guò)夜的菌液中以1∶100接種到6.0 mL LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，當(dāng)菌液D（λ）值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.4 mmol·L－1的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），分別在37℃和20℃條件下誘導(dǎo)。收集菌液，超聲破碎，取樣，聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)蛋白表達(dá)及可溶性情況。將誘導(dǎo)收集的菌體懸浮在25.0 mL裂解液［20.0 mmol·L－1三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl），pH 8.5，200.0 mmol·L－1氯化鈉，50.0 g·L－1甘油］，超聲破碎，4℃，17 500 r·min－1離心，上清轉(zhuǎn)移至鎳柱，在冰上用搖床緩慢結(jié)合1.0～1.5 h后，分別用不同咪唑濃度梯度的緩沖液（0/20.0/40.0/60.0/ 80.0 mmol·L－1咪唑，20.0 mmol·L－1三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl）pH 8.5，200.0 mmol·L－1氯化鈉）洗脫非特異性結(jié)合的雜蛋白，用洗脫液（100.0/200.0/300.0 mmol·L－1咪唑，20.0 mmol·L－1Tris-HCl pH 8.5，200.0mmol·L－1氯化鈉）洗脫目的蛋白。將洗脫的目的蛋白在10 kDa濃縮柱中濃縮至500.0 μL左右，用于分子篩層析，將濃縮的蛋白上樣，收集蛋白，用SDS-PAGE檢測(cè)，將純度較高的蛋白組份濃縮，－80℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 PeRP1基因克隆

以毛竹cDNA為模板，PCR克隆得到1條約為1.3 kb的片段（圖1），雙向測(cè)序拼接后，發(fā)現(xiàn)該片段包含1個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框（ORF），長(zhǎng)度為1 275 bp。

2.2 PeRP1的生物信息學(xué)分析

2.2.1 PeRP1蛋白序列與保守結(jié)構(gòu)域 將PeRP1 cDNA序列中ORF框概念性翻譯成蛋白質(zhì)氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)PeRP1編碼1個(gè)含有425氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。此蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為 46.28 kDa，等電點(diǎn)為 8.04，第138～404氨基酸殘基為丙酮酸磷酸激酶調(diào)節(jié)蛋白的保守區(qū)DUF299（圖2）。

圖1 PeRP1基因的克隆Figure 1 Cloning of the PeRP1 gene

圖2 毛竹PeRP1基因開(kāi)放閱讀框及氨基酸序列（圖中黑框?yàn)镈UF299結(jié)構(gòu)域）Figure 2 ORF of PeRP1 gene and the corresponding amino acid sequence

2.2.2 PeRP1氨基酸序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 通過(guò)對(duì)不同植物來(lái)源RP1進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，毛竹PeRP1編碼的蛋白序列與短花藥野生稻Oryza brachyantha的一致性高達(dá)91%，與玉米的一致性達(dá)70%，而與擬南芥的只有57%，在DUF299區(qū)序列相似度較高，都屬于kinase-PPPase超家族（圖3），說(shuō)明植物RP1蛋白結(jié)構(gòu)和功能較為保守。進(jìn)一步采用MEGA5軟件構(gòu)建了基于PeRP1編碼的氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖4）。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明：系統(tǒng)樹(shù)明顯分為單子葉植物與雙子葉植物2大分枝，其中單子葉植物分枝中，毛竹與短花藥野生稻，烏拉爾圖小麥Triticum urartu，二穗短柄草Brachypodium distachyon位于同一小分枝上，該分枝RP1來(lái)源于C3植物，但與單子葉C4植物及雙子葉植物的RP1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，由此可推測(cè)毛竹植物光合碳循環(huán)可能為C3植物類型。

2.3 PeRP1重組蛋白的可溶性表達(dá)

將不同片段PeRP1重組子轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株Escherichia coli（Ril）感受態(tài)細(xì)胞，異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)后， SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)（圖5），毛竹RP1在37℃和20℃下均有表達(dá)， 但上清中只有20℃有表達(dá)，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中確定20℃為重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件。

2.4 PeRP1蛋白Ni-NTA純化

將超聲破碎離心后的上清加入Ni-NTA柱，帶有組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白特異性結(jié)合到Ni-NTA上，采用不同咪唑濃度梯度洗脫雜蛋白后，利用高濃度的咪唑洗脫出目的蛋白。圖6為咪唑梯度洗脫蛋白后的SDS-PAGE檢測(cè)，可以看出：在低濃度咪唑洗脫條件下可以很好的除去雜蛋白，在高濃度咪唑200.0 mmol·L-1條件下，則可很好洗脫出條帶單一目的蛋白，因此，PeRP1蛋白Ni-NTA親和層析純化的條件為：40.0 mmol·L－1咪唑，20.0 mmol·L－1Tris-HCl pH 8.5，200.0 mmol·L－1氯化鈉，洗脫雜蛋白；200.0 mmol·L－1咪唑，20.0 mmol·L－1Tris-HCl pH 8.5，200.0 mmol·L－1氯化鈉洗脫出目的蛋白。

圖3 不同植物RP1多序列比對(duì)Figure 3 Sequence multiple alignment of RP1 from different plants

2.5 PeRP1片段蛋白的分子篩層析

對(duì)上一步Ni-NTA純化得到的蛋白，進(jìn)一步純化。目的蛋白在經(jīng)過(guò)Superose 12 10/300 GL分子篩層析后，出現(xiàn)3個(gè)明顯的吸收峰。對(duì)比小牛血清白蛋白（BSA）出峰位置（單體D峰對(duì)應(yīng)分子量為67 kDa，二聚體E峰對(duì)應(yīng)分子為134 kDa），A峰對(duì)應(yīng)的是RP1多聚體，B峰對(duì)應(yīng)的是RP1二聚體100 kDa，C峰對(duì)應(yīng)的是RP1單體50 kDa（圖7B）。分子篩層析后分管收集蛋白，取樣變性后跑SDS-PAGE膠（圖7A），結(jié)果顯示：不同的RP1蛋白聚合狀態(tài)的電泳條帶均同RP1理論分子量50 kDa一致，且蛋白純度在95%左右，說(shuō)明RP1蛋白在溶液中存在多種蛋白聚合體狀態(tài)，Ni-NTA結(jié)合SEC可分離純化得到不同狀態(tài)的高純度RP1蛋白，可滿足今后蛋白晶體生長(zhǎng)的要求。

圖4 不同植物RP1氨基酸序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 4 Molecular phylogenetic tree of RP1 from different plants

圖 5 PeRP1在表達(dá)菌株 Escherichia coli（Ril）中的表達(dá)Figure 5 Prokaryotic expression of PeRP1 in Escherichia coli（Ril）cells

圖 6 PeRP1 Ni-NTA親和層析純化的SDSPAG檢測(cè)Figure 6 SDS-PAG analysis from Ni-NTA affinity chromatography of PeRP1

3 討論

植物RP1作為C4途徑中的一種調(diào)節(jié)酶，決定了C4途徑光合作用的光合效率，對(duì)于植物的產(chǎn)量有重要影響。玉米R(shí)P1具有Ser/Thr激酶和磷酸酶活性，通過(guò)對(duì)PPDK調(diào)控位點(diǎn)Thr-456的氨基酸殘基進(jìn)行可逆磷酸化來(lái)調(diào)控PPDK失活（磷酸化）和PPDK活化（去磷酸化）［8－10］，該過(guò)程是以腺苷二磷酸（ADP）為底物去參加調(diào)控反應(yīng)的［10－11］。整體而言，RP1同大多數(shù)激酶調(diào)節(jié)蛋白不同，其具有3個(gè)顯著特征：①RP1為雙功能酶，即該蛋白同時(shí)具有蛋白激酶和磷酸酶活性，而大多數(shù)調(diào)節(jié)酶這兩個(gè)功能是分開(kāi)的［12］；②催化底物去磷酸化時(shí),依賴無(wú)機(jī)磷酸,生成焦磷酸；③催化底物磷酸化時(shí)，以ADP為底物，而不是以ATP作為底物［10－11］，證明與大多數(shù)蛋白磷酸酶通過(guò)水解去磷酸化的機(jī)制不同［13］。

圖7 PeRP1分子篩層析圖（A）及SDS-PAGE檢測(cè)（B）Figure 7 Purification of PeRP1 and BSA by size exclusion chromatography（A）and SDS-PAGE of SEC（B）

本研究首次成功克隆到了毛竹PeRP1基因，該基因具有1個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼425個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)其含有1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域UDF299，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)毛竹RP1與同源RP1都含有這一保守結(jié)構(gòu)域，屬于kinase-PPPase超家族。由于RP1是植物光合碳循環(huán)中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)蛋白，結(jié)合蛋白序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的結(jié)果，毛竹與C3植物的RP親緣性較高，證明C3植物同樣具有C4途徑的酶，這一結(jié)論與唐文莉等［14］和黃啟民等［15］研究結(jié)果相吻合。

從本研究PeRP1蛋白SEC純化的結(jié)果來(lái)看，毛竹PeRP1在20.0 mmol·L－1三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl）pH 8.5，200.0 mmol·L－1氯化鈉溶液條件下，RP1以多聚體、二聚體、單體3種聚體形式存在，其中多聚體形式所占比例較高，而這一現(xiàn)象與我們實(shí)驗(yàn)室純化得到的擬南芥AtRP1蛋白在溶液中只存在二聚體形式有明顯不同，可以推斷單子葉毛竹PeRP1與雙子葉擬南芥AtRP1在結(jié)構(gòu)上可能存在差異，即毛竹RP1可能是通過(guò)二聚體或多聚體形式參與PPDK的調(diào)節(jié)，結(jié)合分子進(jìn)化樹(shù)，也可推測(cè)C3植物同C4植物及單子葉同雙子葉植物中RP1蛋白空間結(jié)構(gòu)也可能存在差異。SEC中PeRP1的多聚體究竟是幾聚體還需分析超速離心實(shí)驗(yàn)（AUC）做進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究在獲得較純的毛竹RP1蛋白后，也做了后續(xù)RP1結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，但到目前為止一直未獲得理想蛋白晶體，推測(cè)毛竹RP1在液體條件下存在不同聚合體狀態(tài)，可能直接影響到RP1均一蛋白質(zhì)晶核的形成。

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Cloning,expression and purification of pyruvate,orthophosphate dikinase regulatory proteins from Phyllostachys edulis

WANG Chaoli,ZHANG Zhijun,QU Yaping,WANG Lei
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

Pyruvate orthophosphate dikinase regulatory protein（PPDK-RP）is a key protein in C4photosynthesis and can modified enzyme activity of PPDK.For Phyllostachys edulis,an important economic bamboo species,cloning PPDK-RP gene and studying its functions had vital theoretical value and application for bamboo photosynthesis research.Firstly PeRP1 was successfully cloned by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）,and afterward a multiple sequence alignment and phylogenetic analysis was conducted. Then for further study the crystal structure of the PeRP protein,the recombinant expression pe-SUMO vectors of PeRP were constructed and the protein was expressed in E.coli and purified by nickle beads column and size column.Results showed that the PeRP gene contained a 1.275 kb open reading frame（ORF）coding a 425 amino acid polypeptide,which contained the typical domain of UDF299 and was predicted as a number of kinase-PPPase superfamily.The multiple sequence alignment and phylogenetic analysis of PeRP revealed that Phyllostachys edulis was a typical C3monocotyledon.Expressed soluble PeRP1 protein had three forms--polymer,dimmers,and monomers in water soultion.These provided a foundation for the structure and function of RP.［Ch,7 fig.15 ref.］

botany;Phyllostachys edulis;pyruvate,orthophosphate dikinase regulatory proteins;gene cloning; prokaryotic expression;protein purification

S718.3

A

2095-0756（2015）05-0749-07

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.05.014

2014-11-28；

2015-01-09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31270715）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY14C160009）

王超莉，從事生物技術(shù)與種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail：709927765@qq.com。通信作者：張智俊，副教授，博士，從事生物技術(shù)與種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail：397942805@qq.com