繆福俊，蔣 宏，王宏虬，原曉龍，陳 劍，楊宇明，王 娟

（1.云南省林業(yè)科學(xué)院 國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明650201；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明650224）

黃花杓蘭菌根真菌rDNA ITS的多樣性

繆福俊1，蔣 宏1，王宏虬2，原曉龍1，陳 劍1，楊宇明1，王 娟1

（1.云南省林業(yè)科學(xué)院 國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明650201；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明650224）

杓蘭屬Cypripedium植物因具較高的觀賞和藥用價(jià)值而長(zhǎng)期被過(guò)度采集，已成為瀕危植物。菌根真菌是其栽培和保育能否成功的重要協(xié)同因子。采用免培養(yǎng)技術(shù)對(duì)滇西北4個(gè)不同居群的黃花杓蘭Cypripedium flavum毛根的真菌進(jìn)行核糖體脫氧核糖核酸內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA ITS）區(qū)段擴(kuò)增。結(jié)果表明：從4個(gè)居群的毛根中共克隆得到366個(gè)真菌ITS-taxa，其中白水河居群93個(gè)，石卡雪山居群90個(gè)，天生橋居群103個(gè)，納帕村居群80個(gè)；黃花杓蘭毛根系統(tǒng)中存在豐富多樣的菌根真菌類(lèi)型，分別涉及膠膜菌屬Tulasnella，伏革菌屬Corticium，瘤菌根菌屬Epulorhiza和絲核菌屬Rhizoctoia 4個(gè)屬及一類(lèi)歸屬未定的真菌（uncultured mycorrhizal fungi）；膠膜菌屬對(duì)于黃花杓蘭具有一定的寄主專(zhuān)一性特征，可能對(duì)黃花杓蘭的生長(zhǎng)有促生作用。以上結(jié)果為菌肥的研制和黃花杓蘭植物的栽培與保育工作提供科學(xué)依據(jù)。圖1表3參24

微生物學(xué)；黃花杓蘭；菌根真菌；rDNA ITS；膠膜菌屬；多樣性

Key words:microbiology;Cypripedium flavum;mycorrhizal fungi;rDNA ITS;Tulasnella；diversity

黃花杓蘭Cypripedium flavum屬蘭科Orchidaceae杓蘭屬Cypripedium植物，為中國(guó)特有種，分布于云南西北部、西藏東南部、四川、甘肅南部和湖北西部的高海拔地區(qū)，是一種典型的多年生高山草本植物［1］。因其花型獨(dú)特、色彩艷麗，是整個(gè)蘭科植物中最具特色的類(lèi)群之一，極具觀賞價(jià)值。然而，人類(lèi)對(duì)杓蘭野生環(huán)境的日益破壞，使得黃花杓蘭種群數(shù)量急劇下降。該種已處于瀕危狀態(tài)，亟待保護(hù)［2－3］。目前，在杓蘭屬植物保育工作中，因多數(shù)自花不育導(dǎo)致自然結(jié)實(shí)率較低，種子微小，多采取分株繁殖和組織培養(yǎng)方式進(jìn)行擴(kuò)繁種苗［4－5］。在此過(guò)程中存在一個(gè)很大的瓶頸：在擴(kuò)繁種苗過(guò)程中，杓蘭幼苗出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、死亡率高等常見(jiàn)問(wèn)題，極大地限制了瀕危植物杓蘭的保育工作［6－7］。前人的研究表明：蘭科植物對(duì)菌根真菌具有較高的依賴性，菌根可能成為杓蘭營(yíng)養(yǎng)代謝的重要協(xié)同因子［8］。在自然條件下，蘭屬植物必須與真菌建立共生關(guān)系，其種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)發(fā)育以及成年蘭屬植物營(yíng)養(yǎng)的獲取才得以實(shí)現(xiàn)［9］。Harley等［8］于1983年首次證實(shí)杓蘭和真菌是互利的關(guān)系。同時(shí)Hadley等［10］也認(rèn)為：平衡的共生關(guān)系可在一定條件下變?yōu)榧纳P(guān)系，接種根際促生菌可顯著提高杓蘭幼苗的成活率。Shimura等［11］的研究表明：兩者可能是斗爭(zhēng)的關(guān)系，但通過(guò)前期的斗爭(zhēng)，一旦真菌與杓蘭建立共生關(guān)系后，可互利共生。王瑞苓等［12］通過(guò)對(duì)黃花杓蘭植株根的生長(zhǎng)周期切片觀察，也證實(shí)菌根真菌與黃花杓蘭是互惠互利的共生關(guān)系。臧穆等［13］在黃花杓蘭的根際和根皮層細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了不同階段的小型菌核，菌核的存在表明：杓蘭和真菌是協(xié)同的關(guān)系。侯天文等［14］研究發(fā)現(xiàn)：四川黃龍溝杓蘭的菌根真菌多樣性隨生長(zhǎng)季節(jié)轉(zhuǎn)換呈現(xiàn)的變化規(guī)律與營(yíng)養(yǎng)需求規(guī)律是基本一致的。高倩等［15］對(duì)黃花杓蘭，云南杓蘭Cypripedium yunnanense,西藏杓蘭Cypripedium tibeticum和斑花杓蘭Cypripedium guttatum的菌根結(jié)構(gòu)及其周年動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)真菌的新近入侵、開(kāi)始被消解、消解后的殘余及消解后的物質(zhì)4個(gè)階段在這4種杓蘭的生活周期中周而復(fù)始地進(jìn)行。上述前人的研究主要集中于菌根解剖結(jié)構(gòu)特征觀察和真菌的入侵方式等方面，有關(guān)杓蘭屬植物菌根真菌多樣性的研究還缺乏報(bào)道。本研究前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黃花杓蘭在滇西北高海拔區(qū)域分布較多，這為研究杓蘭屬植物菌根真菌提供極好的試驗(yàn)材料。本研究以黃花杓蘭毛根為材料，提取總DNA，采用免培養(yǎng)巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)擴(kuò)增其真菌核糖體脫氧核糖核酸內(nèi)轉(zhuǎn)錄隔離區(qū)（rDNA ITS）區(qū)段，并對(duì)不同居群黃花杓蘭的菌根真菌多樣性進(jìn)行分析，為杓蘭屬植物的保育和開(kāi)發(fā)利用方面提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采樣地的地理位置信息詳見(jiàn)表1。采集時(shí)間為杓蘭花盛開(kāi)期（2013年6月10日）。黃花杓蘭為地生蘭，生于林緣，樣地為腐殖質(zhì)土壤。根據(jù)采樣地點(diǎn)分為4個(gè)不同的居群，對(duì)每種選樣植株（居群）中隨機(jī)選取5株進(jìn)行取樣，在黃花杓蘭的根尖處選取毛根段10個(gè)·株－1，長(zhǎng)約1 cm。用水洗凈根尖土壤，置于裝有十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）緩沖液的1.5 mL離心管中，避光低溫儲(chǔ)存。

表1 滇西北黃花杓蘭采樣居群表Table 1 Sample collection of Cypripedium flavum at Northwest of Yunnan

1.2 方法

1.2.1 樣品總DNA的提取 采用天根DNA試劑盒提取各樣品中的總DNA。

1.2.2 樣品rDNA ITS區(qū)段擴(kuò)增和多樣性分析 采用Nest PCR方法擴(kuò)增，第1輪PCR擴(kuò)增引物為NSI1和NLB4（NSI1：5′-GATTGAATGGCTTAGTGAG-3′，NLB4：5′-GGATTCTCACCCTCTATGA-3′）。反應(yīng)體系為：1.0 μL模板DNA，1.0 μL NSI1，1.0 μL NLB4，9.5 μL雙蒸水（ddH2O），12.5 μL Prime STAR Max DNA Premix（2×）。反應(yīng)條件為：98℃30 s，60℃5 s，72℃10 s，30次循環(huán)，72℃1 min。

第2輪PCR擴(kuò)增引物為NSI1-F和ITS4（NSI1-F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。反應(yīng)體系為：1.0 μL第1輪Nest PCR產(chǎn)物做模板DNA，1.0 μL NSI1-F，1.0 μL ITS4，9.5 μL ddH2O，12.5 μL Prime STAR Max DNA Premix（2×）。反應(yīng)條件為：98℃10 s，55℃5 s，72℃10 s，30次循環(huán)，72℃1 min。

將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶Hinf1和Alu1進(jìn)行酶切分析。反應(yīng)體系為：3.0 μL PCR產(chǎn)物，1.0 μL內(nèi)切酶緩沖液（10×），1.0 μL內(nèi)切酶，5.0 μL雙蒸水。37℃水浴4 h。經(jīng)電泳檢測(cè)，分析限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）帶型。將代表不同的RFLP帶型的單克隆樣品挑出，連接載體pEASYBlunt轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆，用菌液PCR法（M13F、M13R引物）鑒定重組子，確認(rèn)包含重組子的克隆，送上海生工公司用M13F和M13R引物測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAman去除載體后使用在線軟件NCBI Blast進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.3 多樣性指數(shù)計(jì)算 集中性測(cè)度：λ=Σ［Ni（Ni-1）/N（N-1）］；多樣性測(cè)度：D=1-Σ ［Ni（Ni-1）/N（N-1）］，公式中N為樣方中物種總體個(gè)數(shù)，Ni為第i種個(gè)體數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花杓蘭毛根中真菌rDNA ITS區(qū)段聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增結(jié)果

黃花杓蘭部分毛根總DNA的提取電泳結(jié)果如圖1A所示，其真菌rDNA ITS區(qū)段擴(kuò)增結(jié)果如圖1B所示，表明提取的總DNA條帶清晰，采用巢式PCR可較好地?cái)U(kuò)增得到rDNA ITS區(qū)段，大小均在750 bp左右。

圖1 黃花杓蘭毛根中真菌rDNA ITS PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果Figure 1 Agarose gel electrophoresis results of rDNA ITS PCR amplification products of mycorrhizal fungi from Cypripedium flavum

2.2 黃花杓蘭毛根中真菌ITS序列分析結(jié)果

從4個(gè)不同居群黃花杓蘭的毛根中直接提取的總DNA，通過(guò)Nest PCR擴(kuò)增及克隆建立了4個(gè)克隆庫(kù)，總共得到了366個(gè)單克隆，其中從白水河居群中得到93個(gè)單克隆，從石卡雪山居群中得到90個(gè)單克隆，從天生橋居群中得到103個(gè)單克隆，從納帕村居群中得到80個(gè)單克隆。

2.3 不同居群黃花杓蘭ITS序列多樣性分析

從表2可見(jiàn)：白水河居群涉及3個(gè)真菌屬，分別屬于瘤菌根菌屬Epulorhiza，歸屬未定真菌（Uncultured mycorrhizal fungi）和膠膜菌屬Tulasnella，均屬典型的蘭科菌根真菌類(lèi)型。其中，瘤菌根菌屬占大多數(shù)，頻率為58.1%，同源性為97%，其次是膠膜菌屬，與美胞膠膜菌Tulasnella calospora的同源性高達(dá)98%，可初步確定為美胞膠膜菌。集中性指數(shù)λ=0.489，多樣性測(cè)度D=0.511；石卡雪山居群涉及3個(gè)真菌屬，分別屬于膠膜菌屬、絲核菌屬Rhizoctoia和瘤菌根菌屬。其中，膠膜菌屬占大多數(shù)，頻率為41.1%，同源性為98%，其次是絲核菌屬。集中性指數(shù)λ=0.350，多樣性測(cè)度D=0.650；天生橋居群涉及3個(gè)真菌屬，分別屬于膠膜菌屬，伏革菌屬Corticium和瘤菌根菌屬。膠膜菌屬占大多數(shù)，頻率為69.9%，同源性為97%，其次是伏革菌屬。集中性指數(shù)λ=0.568，多樣性測(cè)度D=0.432；納帕村居群涉及1個(gè)真菌屬，全部屬于膠膜菌屬，與美胞膠膜菌的同源性高達(dá)99%。集中性指數(shù)λ=0.640，多樣性測(cè)度D=0.360。

表2 黃花杓蘭菌根真菌rDNA ITS序列的Blast比對(duì)結(jié)果Table 2 Blast results of rDNA ITS sequences of mycorrhizal fungi from Cypripedium flavum

2.4 不同居群黃花杓蘭菌根真菌類(lèi)型

從表3可見(jiàn)：4個(gè)居群的黃花杓蘭菌根系統(tǒng)中涉及4個(gè)真菌屬，其中膠膜菌屬、瘤根菌屬和伏革菌屬隸屬于擔(dān)子菌亞門(mén)Basdiomycotina，絲核菌屬隸屬于半知菌亞門(mén)Deuteromycotina，還有一類(lèi)歸屬未定的真菌，所占頻率最少，為1.0%。說(shuō)明不同居群的黃花杓蘭菌根系統(tǒng)中可能存在豐度不同的真菌菌落結(jié)構(gòu)，如白水河居群真菌群落豐富多樣，涉及3個(gè)真菌屬，但在納帕村黃花杓蘭居群只有膠膜菌屬，其多樣性較為單一。膠膜菌屬在每一個(gè)居群中都出現(xiàn)且占有較大的比例，高達(dá)61.2%。

表3 黃花杓蘭菌根不同屬真菌的比例Table 3 Number ratio from different genus of mycorrhizal fungi from C.flavum

3 結(jié)論與討論

本研究首次采用微生物免培養(yǎng)技術(shù)對(duì)滇西北4個(gè)不同居群的黃花杓蘭植物的毛根總DNA進(jìn)行提取，用真菌ITS區(qū)2對(duì)引物NSI1/NLB4和NSI1-F/ITS4直接擴(kuò)增毛根中真菌的ITS區(qū)段，免去了微生物純培養(yǎng)的過(guò)程。從4個(gè)不同居群的黃花杓蘭毛根中總共克隆得到366個(gè)真菌ITS-taxa，與NCBI數(shù)據(jù)中的菌根真菌進(jìn)行比對(duì)，表明均屬菌根真菌類(lèi)型。說(shuō)明黃花杓蘭菌根系統(tǒng)中存在豐富多樣的真菌類(lèi)型，此方法能較好地反應(yīng)黃花杓蘭菌根中真菌多樣性水平，能快速的獲得菌根真菌生態(tài)系統(tǒng)中的真菌群落類(lèi)型。

目前研究已知，感染蘭科植物根部并能與之共生的真菌類(lèi)型約有擔(dān)子菌亞門(mén)的7個(gè)屬（瘤菌根菌屬，膠膜菌屬，臘殼菌屬Sebacina，念珠菌根菌屬M(fèi)oniliopsis，角擔(dān)菌屬Ceratobasidium，層孔菌屬Fomes和伏革菌屬）；半知菌亞門(mén)的1個(gè)屬（絲核菌屬）和子囊菌亞門(mén)的1個(gè)屬（毛殼菌屬Chaetomium）［16-18］。而本研究發(fā)現(xiàn)：4個(gè)居群黃花杓蘭菌根真菌類(lèi)型（膠膜菌屬、瘤菌根菌屬、絲核菌屬和伏革菌屬）為典型的蘭科植物菌根真菌，均在蘭科植物菌根真菌系統(tǒng)中已報(bào)道。其中，膠膜菌屬在每一個(gè)居群中都占有較大的比例，且在每個(gè)居群中都出現(xiàn)，說(shuō)明膠膜菌屬可能是黃花杓蘭菌根真菌系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)種群，存在著一定的寄主特異性。這與已有的研究結(jié)果一致。對(duì)膠膜菌屬的美孢膠膜菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該菌能促進(jìn)蘭科植物（石斛Dendrobium candidum和地寶蘭Geodorum eulophioides）的種子萌發(fā)，可能對(duì)蘭科植物的定植和生長(zhǎng)有促進(jìn)作用［19］。在本研究的另外3個(gè)居群中都涉及到瘤菌根菌屬真菌，所占比例僅次于膠膜菌屬，說(shuō)明有瘤菌根菌屬對(duì)黃花杓蘭也有著一定的寄主特異性。相關(guān)研究也表明，分離自蘭科植物的瘤根菌屬和膠膜菌屬真菌共同促進(jìn)蘭科植物的生長(zhǎng)發(fā)育［20－21］。Oliveira等［22］對(duì)巴西4種蘭花不同居群的菌根真菌進(jìn)進(jìn)行菌群多樣性研究發(fā)現(xiàn)，其根內(nèi)生真菌主要為臘殼菌屬，高達(dá)81.61%，對(duì)這4種蘭花有著寄主專(zhuān)一性。另外，在3個(gè)居群的黃花杓蘭菌根系統(tǒng)中涉及3種類(lèi)型的真菌，說(shuō)明不同種的真菌能促進(jìn)同一種杓蘭植物生長(zhǎng)發(fā)育。這很可能是因?yàn)檫@些真菌皆能提供蘭科植物萌發(fā)生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它們之間存在營(yíng)養(yǎng)專(zhuān)一性［23－24］，此結(jié)論還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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The rDNA ITS diversity of mycorrhizal fungi with Cypripedium flavum

MIAO Fujun1,JIANG Hong1,WANG Hongqiu2,YUAN Xiaolong1,CHEN Jian1,YANG Yuming1,WANG Juan1
（1.Key Laboratory for Conservation of Rare,Endangered&Endemic Forest Plants,State Forestry Administration, Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants,Yunnan Academy of Forestry, Kunming 650201,Yunnan,China;2.School of Forestry,Southwest Forestry University,Kunming 650224,Yunnan, China）

Cypripedium plants,which are endangered by over-harvesting due to their high ornamental and medicinal value,use mycorrhizal fungi to guarantee cultivation and conservation.In order to explore the diversity of mycorrhizal fungi,the rDNA internal transcribed spacer（ITS）sequences from mycorrhizal fungi of four C.flavum populations（Baishui River,Shika Snow Mountain,Tiansheng Bridge,and Napa Village）were amplified by nested polymerase chain reaction（PCR）methods.Results showed a total of 336 distinct ITS-taxa of C. flavum obtained from clones of mycorrhizal fungi with populations from Baishui River（93）,Shika Snow Mountain （90）,Tiansheng Bridge （103）,and Napa Village （80）.Blast results of rDNA ITS sequences showed a rich diversity in mycorrhizal fungi systems with mycorrhizae belonging to Tulasnella,Corticium,Epulorhiza,and Rhizoctoia.Tulasnella fungi probably had host-specificity and growth-promoting effects on C.flavum.These results may provide a scientific basis for further conservation work of C.flavum and fungal manure development.［Ch,1 fig.3 tab.24 ref.］

S718.81；Q948.12

A

2095-0756（2015）07-0815-06

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.05.024

2014-12-08；

2015-01-22

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃青年項(xiàng)目（2014FD070）；國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)（201204110）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（2013FA054）；云南省社會(huì)事業(yè)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)（2010CA010）；云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才培養(yǎng)項(xiàng)目（2010CI016）；云南藏區(qū)典型區(qū)域生態(tài)安全防控技術(shù)研究及應(yīng)用示范項(xiàng)目；云南省教委濕地生態(tài)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

繆?？。芯繉?shí)習(xí)員，從事根際微生物研究。E-mail：miaofujun@yeah.net。通信作者：王娟，教授，從事植物分子生物學(xué)與植物菌根研究。E-mail：schima@163.com