傅 奇 肖玉娟

一株凝結(jié)芽孢桿菌的篩選及鑒定

傅 奇 肖玉娟

凝結(jié)芽孢桿菌是一種美國FDA批準用于食品的益生菌，可定殖于腸道中并產(chǎn)生乳酸，同時由于其可產(chǎn)生芽孢，不良環(huán)境耐受性好，菌體在通過腸前消化道時可保持較高的存活率，是一種有重要價值的益生菌。但目前我國尚未批準用于食品中，相關(guān)研究較少。本文從土壤中篩選得到一株芽孢桿菌，經(jīng)16s rDNA和生理生化鑒定，確定其為凝結(jié)芽孢桿菌，命名為Bacillus coagulans HXP-1。

材料與方法

1．樣品來源

廈門市菜地土壤。

2．培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基(營養(yǎng)瓊脂，/L)：牛肉膏3g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g；pH 7.0-7.2。

富集培養(yǎng)基（kitahara&suzuki培養(yǎng)基,/L）[1]：葡萄糖20g，酵母提取物5g，蛋白胨5g，瓊脂15g。

發(fā)酵培養(yǎng)基（/L）：葡萄糖 120g，蛋白胨19g，NH4Cl 4g，（NH4）2HPO42g。

產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基（TM培養(yǎng)基，/L）：酵母提取物1g，硫酸銨10g，肉浸膏5g，番茄汁200mL，α-甲基葡糖苷5g，CaCO320g；pH 5.5。

碳水化合物產(chǎn)酸培養(yǎng)基 （/L）：（NH4）2HPO41g，KCl 0.2g，MgSO40.2g，酵母提取物0.2g，瓊脂5g，溴百里酚藍（0.04g/100mL）20mL；碳水化合物1g。

V-P試驗培養(yǎng)基（/L）：蛋白胨 5g，葡萄糖 5g，K2HPO45g；pH 7.0-7.2。

CASO肉湯（/L）：胰蛋白胨 17g，大豆木瓜蛋白酶消化物 3g，氯化鈉 5g，磷酸二氫鉀 2.5g，葡萄糖2.5g，pH 7.3。

蛋白胨水培養(yǎng)基（/L）：蛋白胨 1g，NaCl 0.5g；pH 7.8。

DNA酶試驗培養(yǎng)基(/L)：酪朊水解物 15g，大豆蛋白胨5g，NaCl 5g，DNA 2g，甲苯胺藍0.1g，瓊脂15g。

3．菌種篩選

取1g土樣，加入10mL無菌富集培養(yǎng)基中，80℃處理30min后，于30℃厭氧培養(yǎng)，當培養(yǎng)液pH下降至4.0后，以生理鹽水稀釋至10-8，各稀釋度涂布篩選平板，平板密封后37℃培養(yǎng)，生成菌落后挑取菌落測定接觸酶和觀察生孢情況，取接觸酶陽性并產(chǎn)芽孢的菌落繼續(xù)純化。

4．菌種鑒定

由國家海洋局第三海洋研究所進行16s rDNA鑒定，生理生化鑒定依據(jù)《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[2]《伯杰細菌鑒定手冊》[3]與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[4]進行，乳酸檢測按照《食品添加劑乳酸（GB 2023-2003）》[5]進行。

結(jié)果與討論

從廈門市菜地土壤中篩選得到一株產(chǎn)乳酸的、產(chǎn)芽孢的菌株，編號HXP-1，經(jīng)純化保藏后，送至國家海洋局第三海洋研究所——中國海洋微生物菌種保藏管理中心，進行16s rDNA鑒定。

1．16s rDNA鑒定結(jié)果

測序結(jié)果顯示HXP-1 16S rDNA序列長度為1514 bp，堿基序列如下：

16s rDNA序列通過細菌模式種網(wǎng)站對比，結(jié)果顯示菌株HXP-1與8株模式種的16s序列相似度高于99.5%。

表1 HXP-1菌株16s序列EZTaxon網(wǎng)站對比結(jié)果

16s rDNA序列通過NCBI比對，結(jié)果顯示菌株HXP-1與100余株菌株的16s序列相似度高于99%，相似菌株包括Bacillus subtilis（枯草芽孢桿菌）、Bacillus amyloliquefaciens（解淀粉芽孢桿菌）、Bacillus methylotrophicus（甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌）、Bacillus polyfermenticus（多酵解芽孢桿菌）、Bacillus velezensis（貝萊斯芽孢桿菌）等。

表2 HXP-1菌株16s序列NCBI網(wǎng)站對比結(jié)果

經(jīng)中國海洋微生物菌種保藏管理中心16s rDNA測序，該菌株初步判斷為芽孢桿菌群的一個種。

2．生理生化鑒定結(jié)果

生理生化試驗結(jié)果如表3所示，參考《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[2]《伯杰細菌鑒定手冊》[3]與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[4]可知，菌株HXP-1屬于凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans），命名為Bacillus coagulans HXP-1。

表3 HXP-1菌株生理生化試驗結(jié)果

討論與分析

芽孢桿菌由于菌種間親緣關(guān)系較近，常用的16s rDNA難以鑒定到種，因此鑒定時通常需進行生理生化鑒定或看家基因測序，本文中篩選到的菌株Bacillus coagulans HXP-1，其16s rDNA序列與多種芽孢桿菌具有極高的相似度，生理生化結(jié)果與凝結(jié)芽孢桿菌完全吻合，但與此同時，與NCBI基因庫比對時發(fā)現(xiàn)該菌株與已登記在庫的凝結(jié)芽孢桿菌16s序列差異較大，相似度最高僅為93%，表明該菌株在部分生理和代謝特性方面可能與多數(shù)凝結(jié)芽孢桿菌存在差異，具有重要研究價值。

（作者單位：廈門華廈學院）

[1]Stephanie Doores,Dennis Westhoff.Journal of Food Science[J].1981,46∶810-812.

[2]凌代文,東秀珠.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京∶中國輕工業(yè)出版社,1999∶29-31.

[3]布坎南R E,吉本斯N E.伯杰細菌鑒定手冊 [M].第8版.北京∶科學出版社,1984∶170-178.

[4]東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊 [M].北京∶北京科學出版社,2001∶43-65.

[5]GB 2023-2003，食品添加劑乳酸[S].

圖片來自網(wǎng)絡(luò)