徐 丹， 陸信曜， 諸葛斌*， 張 成， 宗 紅

（1．江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122；2.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

高滲工業(yè)菌株Candida glycerinogenes整合型表達載體的構建及驗證

徐 丹1，2， 陸信曜1，2， 諸葛斌*1，2， 張 成1，2， 宗 紅1，2

（1．江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122；2.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

構建應用于工業(yè)用產甘油假絲酵母（Candida glycerinogenes）CGMCC NO.6830的整合型表達載體，建立一種可利用底物形成的滲透壓調控表達外源基因的體系。以pUC19質粒為基本骨架，C.glycerinogenes CGMCC NO.6830的18S rDNA為整合位點，運用其3-磷酸甘油脫氫酶基因啟動子PCggpd啟動外源基因表達，腐草霉素抗性基因ble作為重組酵母轉化子篩選標記，獲得應用于產甘油假絲酵母的穩(wěn)定的表達型整合載體；以綠色熒光蛋白基因gfp作為報告基因考察該表達質粒的性能，實現了外源基因gfp的滲透壓調控表達。

產甘油假絲酵母；3-磷酸甘油脫氫酶基因啟動子；綠色熒光蛋白；整合型載體；高滲表達

產甘油假絲酵母 （Candida glycerinogenes CGMCC NO.6830）是從自然界中分離出來的一種耐高滲工業(yè)菌株，能夠在超高滲透壓（55 g/dL葡萄糖）下快速生長，該菌能夠適應不同的逆境，轉化率及耗糖率極高，目前應用于工業(yè)甘油的生產[1]。與其他酵母相比，它具有生長速度快、耐高滲透壓、甘油產率高等諸多優(yōu)勢[2]，在生物合成1，3丙二醇、二羥基丙酮、3-羥基丙酸等重要化合物方面有廣泛的應用前景[3]，是基因工程領域潛在的優(yōu)良宿主。而目前對該菌分子水平的研究較少，適用于該菌的轉化載體非常缺乏，致使該工業(yè)菌株的應用潛力沒有充分發(fā)揮，因此急需構建適用于該菌的轉化載體，創(chuàng)建適用于該菌的的轉化體系。

目前沒有從該菌中提取到游離質粒，也沒有發(fā)現適用于該菌株的游離載體，因此需要找到合適的整合位點及適用于該菌的強啟動子來構建整合型載體。有研究表明，在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因組中rDNA有100～200個重復單元，以此為整合位點的策略已在釀酒酵母、產朊假絲酵母 （Candida utilis） 和 乳 酸 克 魯 維 酵 母（Kluyveromyces lactis）等多種微生物中展開研究應用[4-5]。作者所在實驗室前期研究表明，產甘油假絲酵母C.glycerinogenes CGMCC NO.6830的胞漿3-磷酸甘油脫氫酶基因CgGPD是其高產甘油的關鍵基因[6-8]，CgGPD受滲透壓應激后酶活大幅度提高，且比已有廣泛研究的不耐高滲壓的S.cerevisiae和耐 高 滲 壓 的 Debaryomyceshansenii以 及Zygosaccharomyces rouxii都要高[9]，關鍵因素之一是其高效的受滲透壓調控啟動子PCggpd，并且高滲條件可大幅度提高其酶活表達，該啟動子在高滲條件下表達外源基因具有極大的應用前景[10]，已經廣泛應用于外源基因的表達，例如：熒光蛋白、漆酶、β-葡糖醛酸糖苷酶[11-13]。綠色熒光蛋白（GFP）最初是從維多利亞發(fā)光水母（Aequorea victoria）中分離得到，是應用最多的發(fā)光蛋白，其作為報告基因具有熒光穩(wěn)定、檢測方便、表達無種族特異性等優(yōu)點，近年被廣泛應用于生命科學領域[14-15]。

作者以低相對分子質量的pUC19質粒為骨架，C.glycerinogenes 18S rDNA為整合位點、胞漿3-磷酸甘油脫氫酶基因啟動子PCggpd為啟動基因，構建應用于產甘油假絲酵母C.glycerinogenes CGMCC NO.6830的整合型表達載體，并以綠色熒光蛋白基因gfp為報告基因，使用葡萄糖、NaCl、KCl和山梨醇等滲透壓調節(jié)劑，考察該表達體系的滲透壓調控表達性能，研究結果為該酵母遺傳學研究及工業(yè)化分子水平改造應用提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 菌株、質粒及引物見表1-2。

1.1.2 主要試劑 質粒提取試劑盒、DNA片段回收試劑盒：購自上海捷瑞生物技術有限公司；各種DNA限制性內切酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA酶、反轉錄試劑盒和瓊脂糖等：大連TaKaRa公司產品；腐草霉素Zeocin：購自上海生工生物技術有限公司；蛋白胨和酵母提取物：購自英國Oxiod公司；qRT-PCR UltraSYBR Mixture：購自康為世紀生物科技有限公司；其余試劑均購自國藥集團。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0；YEPD培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20g/L，pH 6.0；YEPD高滲培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基分別額外添加葡萄糖、NaCl、KCl和山梨醇等滲透壓緩沖劑，pH 7.0。E.coli JM109采用LB培養(yǎng)基，37℃條件下培養(yǎng)12 h；C.glycerinogenes CGMCC NO.6830采用YEPD培養(yǎng)基，于30℃條件下培養(yǎng)18 h；產甘油假絲酵母轉化子 C.glycerinogenes-gfp分別用YEPD和高滲培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)。抗生素使用濃度：氨芐青霉素100 mg/L，Zeocin 150 mg/L。

表1 文中所涉及的菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this paper

表2 文中所用到的引物Table 2 Primers used in this paper

1.2 方法

1.2.1 整合載體pUC-18S rDNA-PCggpd-ble的構建 以產甘油假絲酵母基因組DNA為模板，18S rDNA1/18S rDNA2、PCggpdN/PCggpdS為引物，PCR擴增得到 18S rDNA （GenBank登錄號為 No. AY584809.1）與CgGPD啟動子PCggpd（GenBank登錄號為No.EU186536）；同時以質粒pGAPZ b為模版，以bleS/bleB為引物PCR擴增得到Zeocin抗性基因ble，并外加了插入外源基因的多克隆位點MCS。純化后的 PCR產物分別連入 pMD18-T vector。重組質粒T-18Sr DNA、T-PCggpd和T-ble經酶切后，依次插入到質粒pUC19中，按常規(guī)方法轉化E.coli JM109，得到重組質粒pUC-18S rDNAPCggpd-ble，并進行酶切驗證。

1.2.2 電轉化構建重組菌C.glyceringenes-gfp 以pCAMBIA1302為模板，以gfpS/gfpB為引物，PCR擴增得到綠色熒光蛋白基因gfp，酶切后插入載體pUC-18S rDNA-PCggpd-ble多克隆位點，得到重組載體pUC-18S rDNA-PCggpd-ble-gfp。經Hind III線性化處理后，采用電轉化法轉入產甘油假絲酵母，利用選擇培養(yǎng)基SM平板 （YEPD+150 mg/L zeocin）篩選穩(wěn)定陽性轉化子。電轉化方法及條件詳見文獻[16]。

1.2.3 熒光顯微鏡檢測 挑取重組產甘油假絲酵母單菌落，30℃、200 r/min振蕩過夜，分別接種于50 mL YEPD和高滲培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)至OD600值約為1，室溫下離心收集菌體沉淀，用PBS緩沖液洗滌2次后重懸。取適當菌液涂片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。出發(fā)菌按上述方法處理作為對照。

1.2.4 整合效率及陽性率計算方法 電轉化構建重組菌株時做三組平行實驗，測量線性化質粒濃度，將10 μL該線性化質粒電轉化到出發(fā)菌株，涂布含Zeocin選擇性平板，計數轉化子個數。

整合效率=轉化子數/質粒量

計算得到整合效率，單位為CFU/μg質粒。挑取轉化子接種于YEPD液體培養(yǎng)基，經過熒光檢測，計算得到陽性重組菌比例。

1.2.5 實時定量PCR（qRT-PCR） 重組酵母培養(yǎng)方法同1.2.3。酵母總RNA提取方法參見文獻[17]。反轉錄及實時定量PCR方法與條件參見試劑盒說明書。內參基因選用產甘油假絲酵母18S rDNA基因，18SrDNA1/18S140、gfpS/gfp140作為 18S rDNA與gfp定量PCR時的引物。相對轉錄強度是以該重組酵母55 g/dL葡萄糖質量濃度下轉錄水平作為對照值1，在不同種類滲透壓及不同濃度滲透壓下的轉錄水平與之作為對比。

1.2.6 重組菌穩(wěn)定性檢驗 產甘油假絲酵母重組菌C.glyceringenes-gfp在YEPD選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，以10-3稀釋度接種于YEPD非選擇性培養(yǎng)基中，在30℃下培養(yǎng)15 h，計10代。菌液適當涂布于YEPD非選擇性培養(yǎng)基中，3 d后將平板復制到選擇性培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，計數得Zeocin抗性的酵母轉化子所占比例，每次計數的總酵母菌落在300個以上[3]，同時對子代轉化子進行熒光觀察。

2 結果與分析

2.1 滲透壓調控整合表達載體的構建及含gfp重組菌的構建

該載體以18S rDNA為整合位點，以受滲透壓調控的甘油合成關鍵酶CgGPD啟動子PCggpd啟動外源基因表達。作者所在研究室已對產甘油假絲酵母的基因組進行了測序，結果顯示CgGPD基因與18S rDNA基因并不在相同的染色體上，因此不會存在以PCggpd和18S rDNA2之間的DNA序列被替換的情況發(fā)生。該載體在大腸桿菌中以氨芐青霉素抗性基因為篩選標記，重組酵母以腐草霉素（商品名Zeocin）抗性基因ble為篩選標記，Zeocin是已知的對產甘油假絲酵母 C.glycerinogenes CGMCC NO.6830最有效的抗生素[18]，該載體還含有供外源基因插入的多克隆位點MCS （酶切位點包括Pst I、Sph I、Xba I、Eac I、BamH I和Kpn I）。該整合型表達載體pUC-18S rDNA-PCggpd-ble構建過程見圖1。重組載體經過Nhe I、Stu I雙酶切后釋放出約0.45、1.0、3.7 kb的條帶，見圖2，與理論值相符，說明載體構建成功。

圖1 整合載體pUC-18S rDNA-PCggpd-ble的構建Fig.1 Construction of pUC-18S rDNA-PCggpd-ble

圖2 重組質粒pUC-18S rDNA-PCggpd-ble和pUC-18S rDNA-PCggpd-ble-gfp的酶切驗證Fig.2 Enzymatic digestion of pUC-18S rDNA-PCggpdble and pUC-18S rDNA-PCggpd-ble-gfp

圖3 以重組菌及出發(fā)菌株染色體DNA為模版的診斷PCR分析Fig.3 Diagnostic PCR analysis on recombinant strain and the wild-type strain

為考察所構建載體的表達特性，引入綠色熒光蛋白基因gfp作為報告基因。擴增得到的gfp插入載體pUC-18S rDNA-PCggpd-ble多克隆位點，得到重組載體 pUC-18S rDNA-PCggpd-ble-gfp，經BamH I和Stu I雙酶切后釋放出0.45、1.0、4.7 kb的條帶，與理論值相符。該載體克隆后經過線性化處理，采用電轉化法轉入產甘油假絲酵母，利用添加Zeocin的選擇培養(yǎng)基平板篩選得到穩(wěn)定陽性轉化子。提取重組菌及出發(fā)菌株染色體DNA，以染色體DNA為模版，18SrDNA1/bleB、18S rDNA/gfpB為引物，擴增得到約為2.7 kb及2.3 kb條帶，見圖3。與理論值相符合，說明目的基因已經成功整合到產甘油假絲酵母18S rDNA。經過計算，該整合載體整合效率約為93 CFU/μg質粒；經過熒光檢測，得到陽性轉化率約為50%～60%。

2.2 整合表達體系外源基因gfp滲透壓調控轉錄和表達分析

將重組菌C.glyceringenes-gfp與出發(fā)菌株分別用YEPD和高滲培養(yǎng)基培養(yǎng)后取樣，用熒光顯微鏡觀察。結果發(fā)現gfp在重組菌中得到表達，整個菌體發(fā)出穩(wěn)定明亮的綠色熒光，而對照菌則無熒光，見圖4。說明所構建的載體已經成功在產甘油假絲酵母中整合并表達外源蛋白。

重組菌在YEPD培養(yǎng)基中熒光較弱，見圖4。當葡萄糖、NaCl、KCl和山梨醇等滲透壓穩(wěn)定劑質量濃度分別達到10、7、10、10 g/dL時，熒光強度有了明顯增強。產甘油假絲酵母最高耐受55 g/dL葡萄糖、10 g/dL NaCl、16 g/dL KCl和25 g/dL山梨醇，而在分別添加最高耐受濃度的高滲培養(yǎng)基中熒光強度達到最大。這表明該整合載體所攜帶的外源基因能在高滲條件下得以表達，且表達強度受產甘油假絲酵母甘油合成關鍵酶胞漿 3-磷酸甘油脫氫酶基因啟動子PCggpd調控。隨著滲透壓的升高啟動強度增大，可實現可控表達。

運用實時定量PCR技術（qRT-PCR）對不同條件下的gfp進行在轉錄水平上的相對定量測定，以產甘油假絲酵母基因組18S rDNA為內參基因，55 g/dL葡萄糖質量濃度下gfp轉錄水平作為對照，結果見圖5。高濃度的滲透壓緩沖劑對gfp的轉錄起到正調控的作用，且葡萄糖與NaCl對其誘導效果最為明顯，同時工業(yè)級葡萄糖不僅廉價易得，而且可以作為發(fā)酵底物直接轉化生成甘油及甘油衍生物。進一步驗證了產甘油假絲酵母甘油合成關鍵酶胞漿3-磷酸甘油脫氫酶基因啟動子PCggpd受滲透壓誘導，為產甘油假絲酵母遺傳背景的研究及高產甘油機理提供了研究基礎。

圖4 重組產甘油假絲酵母在不同滲透壓穩(wěn)定劑條件下培養(yǎng)后GFP的熒光表達檢測（15×40）Fig.4 Observation of GFP in recombinant C.glycerinogenes CGMCC NO.6830 cultivated in YEPD supplemented with various osmotic pressure stabilizers（15×40）

圖5 不同滲透壓穩(wěn)定劑質量濃度下重組菌gfp轉錄水平測定Fig.5 Relative gene transcription levels of gfp in the recombinant strain

2.3 產甘油假絲酵母整合表達體系穩(wěn)定性

一般外源基因整合到宿主染色體DNA中比游離于細胞中更能穩(wěn)定復制和維持，作者構建重組酵母C.glyceringenes-gfp傳代100次后，仍有96%以上細胞對Zeocin具有抗性，說明子代中抗性轉化子比例相對較高，見表3。同時對子代轉化子進行熒光觀察，綠色熒光表達穩(wěn)定。由于Zeocin價格比較昂貴，在重組酵母培養(yǎng)過程中可以考慮不必添加腐草霉素。

表3 重組菌C.glycerinogenes-gfp傳代穩(wěn)定性測定Table 3 Stability of the recombinant C.glycerinogenesgfp

3 結語

產甘油假絲酵母C.glycerinogenes CGMCC NO. 6830具有生長速度快、耐高滲透壓、甘油產率高等諸多優(yōu)勢。作者構建了適用于該酵母的低相對分子質量的整合型表達載體pUC-18S rDNA-PCggpdble，并實現了外源綠色熒光蛋白基因在宿主體內的成功整合與表達。實驗表明，外源基因的表達受啟動子PCggpd的正調控，在其可生長質量濃度范圍內，表達強度隨著滲透壓的升高而增強，能在額外添加55 g/dL葡萄糖、10 g/dL NaCl、16 g/dL KCl、25 g/dL山梨醇等高滲條件下正常表達，且強度達到最大；該載體整合到酵母基因組后非常穩(wěn)定，基因丟失率很低，且生長狀況基本不受外源基因表達影響，這為該工業(yè)酵母的遺傳學研究及以該酵母為宿主的生物轉化平臺的建立提供了重要工具。

[1]Zhuge J，Fang H Y，Wang Z X，et al.Glycerol production by a novel osmotolerant yeast Candida glycerinogenes[J].Appliedmicrobiology and biotechnology，2001，55（6）：686-692.

[2]王正祥，諸葛健，方慧英.耐高滲壓高產甘油的一個假絲酵母新種——產甘油假絲酵母[J].微生物學報，1999，39（1）：68-74. WANG Zhengxiang，ZHUGE Jian，FANG Huiying.A new osmotolerant and glycerol-highly-producing species-Candida glycerolgenesis[J].Acta microbiologica Sinica，1999，39（1）：68-74.（in Chinese）

[3]高曉娜.產甘油假絲酵母WL2002-5整合載體的構建研究[D].無錫：江南大學，2012.

[4]支曉慧，王麗娜，朱平，等.基于rDNA序列的酵母整合載體的構建及應用[J].中國醫(yī)藥生物技術，2011，6（5）：330-335. ZHI Xiaohui，WANG Lina，ZHU Ping，et al.Construction and application of Saccharomyces cerevisiae integration vector based on rDNA sequence[J].Chin Med Biotechnol，2011，6（5）：330-335.（in Chinese）

[5]Klabunde J，Kunze G，Gellissen G，et al.Integration of heterologous genes in several yeast species using vectors containing a Hansenula polymorpha-derived rDNA-targeting element[J].FEMS Yeast Research，2003（4）：185-193.

[6]陳獻忠，方慧英，饒志明，等.產甘油假絲酵母胞漿3-磷酸甘油脫氫酶基因（CgGPD）功能分析[J].微生物學報，2008，48（12）：1602-1608. CHEN Xianzhong，FANG Huiying，RAO Zhiming，et al.Characterization of glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene（CgGPD）from the glycerol producing Candida glycerolgenesis[J].Acta microbiologica Sinica，2008，48（12）：1602-1608.（in Chinese）

[7]陳獻忠，方慧英，饒志明，等.產甘油假絲酵母與釀酒酵母胞漿3-磷酸甘油脫氫酶基因的功能比較[J].生物化學與生物物理進展，2009，36（2）：198-205. CHEN Xianzhong，FANG Huiying，RAO Zhiming，et al.Comparative characterization of genes encoding glycerol-3-phosphate Dehydrogenase from Candida glycerolgenesis and Saccharomyces cerevisiae[J].Prog Biochem Biophys，2009，36（2）：198-205.（in Chinese）

[8]王正祥，諸葛健.產甘油假絲酵母胞3-磷酸甘油脫氫酶編碼基因的克隆[J].微生物學報，1999，39（4）：321-326. WANG Zhengxiang，ZHUGE Jian.Cloning of a gene encoding cytoplasmic glycerol-3-phosphate dehydrogenase from Candida glycerolgenesis[J].Acta microbiologica Sinica，1999，39（4）：321-326.（in Chinese）

[9]陳珺，王正祥，諸葛健.產甘油假絲酵母胞漿3-磷酸甘油脫氫酶在甘油形成中的作用[J].無錫輕工大學學報，1999，18（3）：1-6. CHEN Jun，WANG Zhengxiang，ZHUGE Jian.The role of cytoplasmic glycerol-3-phosphate dehydrogenase of Candida glycerolgenesis on its glycerol over-producing[J].Journal of Wuxi University of Light Industry，1999，18（3）：1-6.（in Chinese）

[10]丁春生，饒志明，諸葛斌，等.利用熒光蛋白研究產甘油假絲酵母胞漿3-磷酸甘油脫氫酶基因CgGPD啟動子[J].微生物學報，2008，48（8）：1013-1018. DING Chunsheng，RAO Zhiming，ZHUGE Bin，et al.Analysis of CgGPD gene promoter from Candida glycerinogenes by fluorescent protein[J].Acta microbiologica Sinica，2008，48（8）：1013-1018.（in Chinese）

[11]Maggi RG，Govind NS.Regulated expression of green fluorescent protein in Debaryomyces hansenii[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2004，31（7）：301-310.

[12]Alves A M，Record E，Lomascolo A，et al.Highly efficient production of laccase by the basidiomycete Pycnoporus cinnabarinus [J].Applied and Environmental Microbiology，2004，70（11）：6379-6384.

[13]Kuo C Y，Huang C T.A reliable transformation method and heterologous expression of β-glucuronidase in Lentinula edodes[J]. Journal of Microbiological Methods，2008，72（2）：111-115.

[14]Zhang C，Zhuge B，Zhan X B，et al.Cloning and characterization of a novel NAD+dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene from Candida glycerinogenes and use of its promoter[J].Yeast，2013（30）：157-163.

[15]Jeffrey D P，Richard N D，Gina M D，et al.Green fluorescent protein and its derivatives as versatile markers for gene expression in living Drosophila melanogaster，plant and mammalian cells[J].Gene，1996（173）：83-87.

[16]Chen X Z，Fang H Y，Rao Z M，et al.An efficient genetic transformation method for glycerol producer Candida glycerinogenes[J]. Microbiol Research，2008，163（5）：531-537.

[17]王晨瑩.產甘油假絲酵母高滲甘油應答途徑關鍵基因CgHOG1的研究[D].無錫：江南大學，2013.

[18]陳獻忠，饒志明，沈微，等.以Zeocin抗性基因為選擇標記的Candida glycerinogenes遺傳轉化[J].激光生物學報，2008，17（2）：176-180. CHEN Xianzhong，RAO Zhiming，SHEN Wei，et al.A transformation system for Candida glycerinogenes based on zeocin resistance[J].Acta Laser Biology Sinica，2008，17（2）：176-180.（in Chinese）

Development and Verification of an Integrative Vector for the Industrial Osmotolerant Yeast Candida glycerinogenes

XU Dan1，2， LU Xinyao1，2， ZHUGE Bin*1，2， ZHANG Cheng1，2， ZONG Hong1，2
（1.SchoolofBiotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.Key Laboratory ofIndustrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To express heterogeneous genes under the regulation of osmotic pressure in Candida glycerinogenes CGMCC NO.6830，an integrative vector was constructed in this study.The constructed integrative vector harbored the backbone of plasmid pUC19，18S rDNA sequence of C. glycerinogenes CGMCC NO.6830 as the integration site，phleomycin-resistant gene（ble）as a selectable marker，the osmolarity regulated promoter（PCggpd）and green fluorescent protein gene gfp as a reporter.The target gene was integrated into chromosomes of C.glycerinogenes CGMCC NO.6830 and the expression level of gfp was regulated by osmotic pressure.

Candida glycerinogenes CGMCC NO.6830，glycerol-3-phosphate dehydrogenase promoter，green fluorescent protein，integrative vector，high osmotic pressure expression

Q 786

A

1673—1689（2015）08—0842—07

2014-04-16

國家863計劃項目（2011AA02A207，2012AA021201）；國家自然科學基金項目（31270080）。

*通信作者：諸葛斌（1969—）男，江蘇無錫人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事工業(yè)微生物分子生物學方面的研究。E-mail：bzhuge@163.com