李 坤， 李江華*，3， 劉 龍，3， 堵國成，2，3， 陳 堅，2，3

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

聚乙烯醇降解菌的篩選與降解條件優(yōu)化

李 坤1， 李江華*1，3， 劉 龍1，3， 堵國成1，2，3， 陳 堅1，2，3

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

為了實現(xiàn)紡織工業(yè)廢水中PVA1799的生物降解，從紡織印染廠區(qū)篩選到一個能快速降解培養(yǎng)基中PVA1799的混合菌系，命名為SH-TD。從中分離出3株純培養(yǎng)菌株，分別命名鑒定為SH1（Aeromonas sp.），TD5（Pseudomonas sp.），TD33（Acinetobacter sp.）。通過對含PVA1799出發(fā)培養(yǎng)基進行單因素及Placckett-Burman實驗篩選出三個對PVA1799降解有顯著影響的因素分別為Yeast-Extract、（NH4）2HPO4、CaCl2·2H2O。然后進行最陡爬坡實驗逼近最佳響應(yīng)面區(qū)域，最后通過Box-Behnken設(shè)計，利用Design-Expert軟件進行回歸分析，得到各因素的最佳質(zhì)量濃度組成為（g/L）：Yeast-Extract 0.04、（NH4）2HPO448.42、BaCl20.06。在最優(yōu)條件下，24 h PVA降解率從原先的30%提高到80%。

聚乙烯醇；混合菌系；生物降解；響應(yīng)面法

聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，簡稱PVA），是目前已發(fā)現(xiàn)的惟一具有水溶性且無毒的高聚物[1]，具有很多優(yōu)良的物理性質(zhì)，如高粘度、成膜性、乳化性、拉伸性、對水、油脂和有機溶劑均有抵抗性等?；谝陨咸匦?，PVA廣泛應(yīng)用于粘合劑、涂料、乳化劑、造紙和紡織等行業(yè)，工業(yè)上通常通過聚醋酸乙烯酯經(jīng)過皂化反應(yīng)制取[2]。PVA的生化性較差（BOD/COD）=0.07，在許多工業(yè)廢水中含有大量的 PVA，直接排放會對環(huán)境帶來了極大的污染[3]。1973年日本科學(xué)家Suzuki首次分離到可以單獨降解PVA的Pseudomonas O-3[4]，隨后幾十年里國內(nèi)外進行了大量的PVA降解微生物的篩選、酶基因的克隆等工作[5-9]。目前已正式報道的PVA降解酶包含三個種類[10]：PVA氧化酶 （仲醇氧化酶）（EC 1.1.3.30）、PVA脫氫酶 （EC 1.1.99.23）和氧化型PVA水解酶 （β-雙酮水解酶）（EC 3.7.1.7）。近年還發(fā)現(xiàn)了專一性比較強的降解低醇解度PVA長鏈上殘存乙酸酯鍵的PVA酯酶[11]。然而大部分報道菌種都存在培養(yǎng)周期長，酶活低等缺點。所克隆出來的PVA脫氫酶更是由于其在作用時需要昂貴的吡咯喹啉醌（PQQ）作為電子受體而在工業(yè)生產(chǎn)中具有很大的局限性，而PVA氧化酶則由于難以純化而至今未能被克隆。因此分離篩選新的PVA降解微生物尤其是具有PVA氧化酶活性的菌株具有十分重要的意義。

作者從紡織廠、印染廠等廢水、土壤及活性污泥中篩選出1株高效降解PVA1799的混合菌系，并從中分離出3種純培養(yǎng)物，通過對所得混菌體系降解PVA的培養(yǎng)基設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化實驗，大大提高了PVA降解酶的產(chǎn)率，縮短了降解時間，為進一步深入研究該混合菌中的PVA降解酶的種類及降解機理提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 取自無錫太平洋和軍達紡織廠等地的廢水、土壤及活性污泥。PVA1799（聚合度1 700，醇解度99%）：由江南大學(xué)紡織服裝學(xué)院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）富集培養(yǎng)基P-Y（g/L）：PVA1799 1，Yeast-Extract 0.1，（NH4）2SO40.5，KH2PO40.02，K2HPO41.6，MgSO4·7H2O 0.05，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，CaCl2· 2H2O 0.01，NaCl 0.02；pH 7.5。

2）鑒定培養(yǎng)基P-Y（g/L）：PVA1799 1，Yeast-Extract 0.1，（NH4）2SO40.5，KH2PO40.02，K2HPO41.6，MgSO4·7H2O 0.05，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，CaCl2· 2H2O 0.01，NaCl 0.02，瓊脂粉20；pH 7.5。待平板長出菌落后傾入15 mL碘-硼酸試劑，避光反應(yīng)10 min，觀察菌落周圍透明圈的產(chǎn)生情況。

3）種子培養(yǎng)基P-TY：20%LB，P-Y。

4）起始發(fā)酵培養(yǎng)基P-Y：同富集培養(yǎng)基。

1.2 篩選及培養(yǎng)方法

1.2.1 菌株篩選與鑒定 將樣品用無菌生理鹽水懸浮，取上清液用富集培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，梯度稀釋至合適濃度，涂布于鑒定培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)3 d。顯色后，挑取有透明圈菌落在鑒定培養(yǎng)基平板上進行多次劃線分離，直至得到純培養(yǎng)菌株即為初篩菌株。接種初篩菌株于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，取3 OD600種子液離心無菌重懸接種發(fā)酵培養(yǎng)基P-Y中傳代馴化并測定PVA含量。

觀察目的菌株菌落形態(tài)、鏡檢并進行革蘭氏染色實驗，提取其16S rDNA并測序，在NCBI上比對所得測序結(jié)果將純菌鑒定到屬 （http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/）。

1.2.2 種子培養(yǎng) 從甘油管中取50 μL菌液于接入裝有20 mL P-TY培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，并在30℃、200 r/min下培養(yǎng)18 h。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 250 mL三角瓶裝液量20 mL，接種量3 OD，30℃、200 r/min培養(yǎng)測定PVA降解率及PVA降解酶總酶活。

1.2.4 粗酶液制備 取發(fā)酵培養(yǎng)液，10 000 r/min離心8 min，所得上清液即為粗酶液組分1。去上清菌體，加等體積的20 mmol/L、pH 7.5 PBS緩沖液重懸后超聲波 （400 W）處理20 min，其中破碎3 s暫停1 s，破壁后10 000 r/min離心8 min，所得上清液即為粗酶液組分2?；旌辖M分1、2即為粗酶液。

1.3 分析方法

1.3.1 菌濃測定 取發(fā)酵液稀釋至合適的吸光度范圍在600 nm處測定其吸光度。

1.3.2 PVA濃度的測定 改良的Finley法[12]。取400 μL發(fā)酵上清液加入10 mL具塞比色管，加入3 mL、25 g/L硼酸溶液，最后加300 μL 0.1 mol/L I2-KI溶液，用去離子水定容至10 mL，避光反應(yīng)10 min，以水替換發(fā)酵上清液作為空白對照，以發(fā)酵前培養(yǎng)基作為標(biāo)準(zhǔn)對照，1 cm光程690 nm波長下測定吸光度。

1.3.3 PVA降解酶總酶活 取粗酶液2 mL，加入15 mL離心管中，與溶解在pH 7.5、20 mmol/L PBS緩沖液中的2 g/L PVA溶液均勻混合，于30℃下振蕩保溫5 h。分別測定反應(yīng)前后混合液在690 nm下的吸光度，每分鐘吸光度下降0.001定義為一個酶活單位（U）[8]。

1.4 培養(yǎng)基優(yōu)化[13]

搖瓶培養(yǎng)基優(yōu)化策略選用響應(yīng)面優(yōu)化，以單因素實驗確定最優(yōu)氮源，通過Plackett-Burman實驗找出對PVA降解有顯著影響的因素，挑選具有顯著效應(yīng)的因素進行最陡爬坡實驗，然后通過爬坡實驗確定中心組合實驗的中心點，最后進行中心組合實驗。使用Design-Expert軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選與鑒定

將從紡織印染廠采集來的土樣、活性污泥樣等用生理鹽水重懸、靜置后取上層清液用富集培養(yǎng)基P-Y培養(yǎng)基于200 r/min、30℃培養(yǎng)，期間間斷取樣測定PVA濃度的變化，每次富集時間6 d。經(jīng)過3次循環(huán)富集馴化，得到一個能在4 d內(nèi)降解P-Y培養(yǎng)基中全部PVA的混合菌體系，命名為SH-TD，這也是本研究后期工作的研究對象。對混合菌系稀釋合適的梯度涂布分離鑒定平板，經(jīng)Finley法顯色后，挑取有透明圈的菌落多次在鑒定培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化，得到了3個菌落形態(tài)不同的純菌落，分別命名為SH1，TD5，TD33，圖1為TD5透明圈圖。以三株菌的基因組為模板，以27F、1492R通用引物PCR分別得到其16S rDNA序列，測序后分別在NCBI上進行比對，三株純菌分別鑒定為Aeromonas sp.，Pseudomonas sp.，Acinetobacter sp.，對3株菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。

圖1 TD5菌落形態(tài)及透明圈Fig.1 Colonial morphology and transparent circle of TD5

圖2 3株P(guān)VA降解菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of three isolated PVA-degrading bacterium

2.2 單因素實驗

在去除氮源的P-Y中，添加不同的氮源 （有機氮源和無機氮源，控制每種氮源的含氮量均為0.2 g/L），探究不同氮源對PVA降解及產(chǎn)酶的影響。添加的有機氮源分別為Yeast-Extract、蛋白胨和牛肉膏；添加的無機氮種類分別為（NH4）2SO4、NH4Cl、（NH4）2HPO4、CH3COONH4、（NH4）2C2O4、檸檬酸三銨、NH4HCO3。每種氮源做三個平行，培養(yǎng)48 h，測定各處理中PVA的濃度。由圖3可見，（NH4）2HPO4為最優(yōu)氮源。

圖3 不同種類氮源對PVA降解率的影響（48 h）Fig.3 Effects of different nitrogen sources on enzyme activity（48 h）

2.3 Plackett-Burman實驗

作者選用實驗次數(shù)N=12的Plackett-Burman實驗設(shè)計，對8個因素進行考察，分別為Yeast-Extract，（NH4）2HPO4，KH2PO4，K2HPO4，MgSO4·7H2O，F(xiàn)eSO4·7H2O，CaCl2·2H2O，NaCl。每個因素分兩個水平，高水平取低水平的1.5倍，響應(yīng)值為培養(yǎng)12 h后培養(yǎng)基中PVA的降解率（%）。實驗設(shè)計及結(jié)果見表1，利用Design-Expert軟件對Plackett-Burman實驗各因素主效應(yīng)分析的結(jié)果見表2。由表2可知，Yeast-Extract、（NH4）2HPO4、CaCl2·2H2O和 KH2PO4這四個因素的可信度都在95%以上，其余四個因素的可信度均低于95%，同時考慮到在進行響應(yīng)面分析時，因素超過3個會使實驗次數(shù)顯著增加，而在以上4個顯著因素中，K2HPO4的影響相對差一些，而且CaCl2·2H2O可能與PVA降解的吸附降解機理有關(guān)。因此確定Yeast-Extract、（NH4）2HPO4、CaCl2· 2H2O為主要影響因素進行下一步實驗。

2.4 爬坡實驗

根據(jù)Plackett-Burman的結(jié)果確定下一步實驗的最陡爬坡路徑。通過PB實驗分析可知，Yeast-Extract有負效應(yīng)，應(yīng)減少；（NH4）2HPO4、CaCl2·2H2O有顯著正效應(yīng)，應(yīng)增加。根據(jù)這三個因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向以及步長，其他五個因素分別取各自的低水平進行實驗，實驗設(shè)計及結(jié)果見表3。從結(jié)果來看，最佳因素的質(zhì)量濃度處于第8組和第9組之間，故以第8組條件為后續(xù)實驗的中心點進行響應(yīng)面分析。

表1 Plackett-Burman實驗設(shè)計和響應(yīng)值Table 1 Plackett-Burman experiment design and its response

表2 Plackett-Burman實驗因素水平及其主效應(yīng)分析Table 2 Levels of variable and analysis of the main effect for Plackett-Burman

表3 爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Experimental design and result of ascent

2.5 響應(yīng)面分析重要因素的最優(yōu)質(zhì)量濃度水平

2.5.1 二次回歸模型擬合及方差分析 根據(jù)Plackett-Burman實驗確定了影響PVA降解速率即產(chǎn)酶的主要因素，Box-Behnken實驗各因素水平見表4，實驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

表4 Box-Behnken實驗因素水平Table 4 Experimental variables and levels for BB design

表5 BB實驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Design and results of BB experiment

以Yd為響應(yīng)值，根據(jù)表5中Box-Behnken設(shè)計的實驗結(jié)果，利用Design-Expert軟件對其結(jié)果進行二次回歸分析，得到回歸方程為：

從方差分析表6中可以看出，模型在α=0.01水平上回歸顯著；同時，一次項、平方項、交叉項均對響應(yīng)值有顯著性影響。模型可信度分析見表7，其中復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方 R2=0.989 5，說明模型可以解釋98.95%實驗所得PVA降解率的變化，表明方程擬合較好。本設(shè)計實驗中CV=2.79%，較低，說明實驗操作可信。綜上說明回歸方程給PVA降解率的變化提供了一個合適的模型。

表6 模型方差分析Table 6 NOVA for the full quadratic model

表7 模型的可信度分析Table 7 Fit statistics for the model

2.5.2 響應(yīng)面分析及最優(yōu)濃度的確定 通過回歸方程分析得到極大值所對應(yīng)主要因素X1、X2、X3，即Yeast-Extract、（NH4）2HPO4和CaCl2·2H2O的質(zhì)量濃度分別為0.04、48.42、0.06 g/L，此時24 h后的PVA降解率最高，為80.84%。以確定的主要因素質(zhì)量濃度配制培養(yǎng)基，分三批次，24 h PVA降解率平均為79.76%，與預(yù)測值基本相符。PVA降解酶酶活大大提高，降解周期縮短至36 h內(nèi)。

圖4 響應(yīng)面立體分析圖及對應(yīng)等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot of central composite experiment

3 結(jié)語

通過富集馴化，得到一個快速降解培養(yǎng)基中PVA1799組分的混合菌系SH-TD，從中分離出三種純菌，它們分別是 SH1 （Aeromonas sp.），TD5（Acinetobacter sp.）和TD33（Pseudomonas sp.）。

采用響應(yīng)面分析法對PVA降解菌降解PVA的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，首先運用Plackett-Burman法確定出Yeast-Extract、（NH4）2HPO4和CaCl2·2H2O為重要影響因素；然后通過最陡爬坡實驗逐步改變?nèi)叩馁|(zhì)量濃度，逼近中心點；最后采用Box-Behnken設(shè)計和Design-Expert軟件分析確定出主要因素的最優(yōu)質(zhì)量濃度，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分（g/L）為：PVA1799 1，Yeast-Extract 0.04，（NH4）2HPO448.42，KH2PO40.02，K2HPO41.6，MgSO4·7H2O 0.05，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，CaCl2·2H2O 0.06，NaCl 0.02；pH 7.5。此時24 h后的PVA降解率最高，為80.0%。降解效率與原初始發(fā)酵培養(yǎng)基相比提高了1.7倍。PVA降解酶總酶活大大提高，為進一步研究打下了堅實的基礎(chǔ)。

[1]Larking D M，Crawford R J，Christie G B Y，et al.Enhanced degradation of polyvinyl alcohol by pycnoporus cinnabarinus after pretreatment with fenton’s reagent[J].Applieal and Environmental Microbiology，1999，65（4）1798-1800.

[2]Chiellini E，Corti A，D'Antone S，et al.Biodegradation of poly（vinyl alcohol）based materials[J].Progress in Polymer Science，2003，28（6）：963-1014.

[3]鞠喜，堵國成，陳堅.金屬離子和醇類對混合菌產(chǎn)聚乙烯醇降解酶的影響[J].工業(yè)微生物，2008，38（2）：15-19. JU Xi，DU Guocheng，CHEN Jian.Effect of metal ions and alcohols on PVA-degrading enzyme produced by mixed baeteria[J]. Industrial Microbiology，2008，38（2）：15-19.（in Chinese）

[4]Suzuki T，Ichihara Y，Yamada M，et al.Some characteristics of Pseudomonas O-3 which utilizes polyvinyl alcohol[J]. Agricultural and Biological Chemistry，1973，37（4）：747-756.

[5]Sakazawa C，Shimao M，Taniguchi Y，et al.Symbiotic utilization of polyvinyl alcohol by mixed cultures[J].Appl Environ Microbiol，1981，41（1）：261-267.

[6]Risse W，Grubbs R H.A novel route to block copolymers by changing the mechanism from living ring-opening metathesis polymerization of cyclic olefins to aldol condensation polymerization of silyl vinyl ethers[J].Macromolecules，1989，22（4）：1558-1562.

[7]Mori T，Sakimoto M，Kagi T，et al.Isolation and characterization of a strain of Bacillus megaterium that degrades poly（vinyl alcohol）[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1996，60（2）：330-332.

[8]Kim B C，Sohn C K，Lim S K，et al.Degradation of polyvinyl alcohol by Sphingomonas sp.SA3 and its symbiote[J].Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology，2003，30（1）：70-74.

[9]Kim M N，Yoon M G.Isolation of strains degrading poly （vinyl alcohol）at high temperatures and their biodegradation ability[J]. Polymer Degradation and Stability，2010，95（1）：89-93.

[10]Sakai K，F(xiàn)ukuba M，Hasui Y，et al.Purification and characterization of an esterase involved in poly（vinyl alcohol）degradation by Pseudomonas vesicularis PD[J].Bioscience，biotechnology，and biochemistry，1998，62（10）：2000-2007.

[11]Finley J H.Spectrophotometric determination of polyvinyl alcohol in paper coatings[J].Analytical Chemistry，1961，33（13）：1925-1927.

[12]曹小紅，蔡萍，李凡，等.利用響應(yīng)面法優(yōu)化Bacillus natto TK-1產(chǎn)脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基 [J].中國生物工程雜志，2007，27（4）：59-65. CAO Xiaohong，CAI Ping，LI Fan，et al.Medium optimization for lipopeptide produced by Bacillus natto TK-1 using response surface methodology[J].China Biotechnology，2007，27（4）：59-65.（in Chinese）

Screening of PVA-Degrading Strains and Optimization of Degradation Conditions

LI Kun1， LI Jianghua*1，3， LIU Long1，3， DU Guocheng1，2，3， CHEN Jian1，2，3
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In order to achieve the biodegradation of PVA1799 in the textile industrial waste water，an bacteria mixture with efficient degradation was screened and named as SH-TD.Three strains with PVA-degrading ability were isolated from the mixed culture SH-TD and nasmed as SH1（Aeromonas sp.），TD5（Pseudomonas sp.），and TD33（Acinetobacter sp.），respectively.The results from the single factor and Plackett-Burman experiments showed that Yeast-Extract，（NH4）2HPO4and BaCl2constituents have the significant influence on PVA degrading rate.Through ascent and Box-Behnken experiments，a response surface methodology（RSM）model was constructed.Data were analyzed by use of Design-Expert software.The optimal concentrations（g/L）of the variables were determined as （g/L）：Yeast-Extract 0.04，（NH4）2HPO4 48.42，BaCl20.06.Under the optimalconditions，the PVA degradation rate after 24 h increased from 30%to 80%.

polyvinyl alcohol，mixed bacteria，biodegradation，response surface methodology

TQ 92

A

1673—1689（2015）08—0835—07

2014-02-19

國家863計劃項目（2012 AA022202）。

*通信作者：李江華（1966—），男，江西九江人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事酶技術(shù)、發(fā)酵過程優(yōu)化與控制方面的研究。E-mail：lijianghua@jiangnan.edu.cn