朱孔亮， 吳 丹， 吳 敬*

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

泡菜發(fā)酵專用短乳桿菌的高密度培養(yǎng)

朱孔亮1，2， 吳 丹1，2， 吳 敬*1，2

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

為了實現(xiàn)泡菜發(fā)酵專用短乳桿菌H3的高密度細(xì)胞培養(yǎng)，考察了培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件、中和劑以及補(bǔ)料策略對菌體活菌數(shù)的影響。結(jié)果表明：菌體適宜培養(yǎng)基配方為葡萄糖25 g/L，酵母粉15 g/L，檸檬酸1.53 g/L，檸檬酸鈉18.58 g/L，VB620 mg/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4· 5H2O 0.25 g/L，Tween-80 1 g/L，在培養(yǎng)過程中使用20%檸檬酸鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值6.8～6.3、培養(yǎng)溫度30℃、裝液量40 mL/250 mL三角瓶，適宜補(bǔ)料培養(yǎng)方式為培養(yǎng)10 h和20 h時各補(bǔ)加4%的碳氮源（碳氮比為5∶3）。培養(yǎng)結(jié)束時培養(yǎng)液中短乳桿菌活菌數(shù)可達(dá)1.27×1010CFU/mL，為未優(yōu)化前的7.5倍，是目前已報道的最高活菌數(shù)水平，為實現(xiàn)泡菜發(fā)酵專用的短乳桿菌發(fā)酵劑的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

短乳桿菌；泡菜發(fā)酵；高密度培養(yǎng)

短乳桿菌是乳酸菌中乳桿菌屬的重要菌種，為革蘭氏陽性菌，廣泛分布于自然界中，具有高產(chǎn)酸、解毒、抑菌和提高機(jī)體免疫力等多種生理功效[1-4]。近年來，隨著人們對短乳桿菌及其代謝產(chǎn)物研究的深入，短乳桿菌已逐漸被廣泛地應(yīng)用在食品生產(chǎn)[5-6]、飼料加工以及畜禽疾病防治[7]等方面。尤其在食品行業(yè)，作為泡菜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物之一，短乳桿菌能夠賦予泡菜獨特的風(fēng)味、質(zhì)地和口感，對泡菜發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)發(fā)揮著不可替代的作用[8]。

傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜因為其生產(chǎn)周期長、風(fēng)味不穩(wěn)定、安全性不高而逐漸被人工接種發(fā)酵泡菜所取代，而人工接種泡菜的關(guān)鍵在于直投式發(fā)酵劑的開發(fā)[9]。目前作為泡菜發(fā)酵專用直投式發(fā)酵劑的短乳桿菌較少[5]，其瓶頸在于難以實現(xiàn)其高密度培養(yǎng)。建立短乳桿菌的高活性、高密度的培養(yǎng)方法，可以減少培養(yǎng)體積、減少設(shè)備投資、縮短生產(chǎn)周期，從而降低生產(chǎn)成本[10]。目前對于短乳桿菌高密度培養(yǎng)以制備直投式發(fā)酵劑的研究很少。賀稚非[11]等2006年將植物乳桿菌和短乳桿菌1∶1混合作為泡菜直投式發(fā)酵劑進(jìn)行了高密度發(fā)酵優(yōu)化，使乳酸菌活菌數(shù)達(dá)到7.24×109CFU/mL。任亞妮[12]等2011年通過響應(yīng)面分析對影響短乳桿菌生長的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，使短乳桿菌菌體濃度達(dá)到5.21×109CFU/mL。

作者所在實驗室從自然發(fā)酵泡菜中分離得到一株產(chǎn)風(fēng)味能力較好的短乳桿菌H3，并成功將其運用于人工接種發(fā)酵泡菜中。作者在此基礎(chǔ)上對H3的高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，綜合運用堿性中和法與補(bǔ)料培養(yǎng)法，以期提高短乳桿菌的培養(yǎng)密度，實現(xiàn)低成本、高效率的培養(yǎng)以適合工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株：短乳桿菌（Lactobacillus brevis H3），由江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室分離。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，K2HPO42 g，醋酸鈉5 g，檸檬酸銨2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，吐溫80 1 g，蒸餾水1 L，pH 6.8，115℃滅菌20 min。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入1.5～2 g/dL瓊脂，用于短乳桿菌的活化、平板活菌計數(shù)。

1.3 試劑

蛋白胨、酵母粉：購自O(shè)xoid公司；其他試劑：均為國產(chǎn)分析純，購自國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌種活化 從-80℃保藏的甘油管中接種于MRS固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落，然后挑取單菌落接入另一個固體培養(yǎng)基，出現(xiàn)菌落后，重復(fù)以上操作3次，即得活化菌種。

1.4.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將活化后的菌種接入MRS液體培養(yǎng)基（50 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶），30℃、200 r/min回轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)32 h。

1.4.3 短乳桿菌活菌計數(shù) 將待測樣品按10倍梯度稀釋，取0.1 mL各稀釋度的菌液，滴加到MRS平板計數(shù)培養(yǎng)基的表面，均勻涂布后置于30℃培養(yǎng)48 h，每一稀釋度重復(fù)3皿，計數(shù)發(fā)酵液活菌數(shù)（CFU/mL）。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基成分的確定

培養(yǎng)基是微生物生存的營養(yǎng)來源，不同微生物所需要的營養(yǎng)成分及濃度配比并不完全相同，需要按照實際情況加以選擇。因此，作者對初始發(fā)酵培養(yǎng)基（MRS）實施進(jìn)一步優(yōu)化，以促進(jìn)菌體的生長。

2.1.1 碳源及其濃度對H3菌體濃度的影響 碳源是微生物生長過程中重要的能量物質(zhì)，作為培養(yǎng)基的主要成分之一，它參與了菌體的生長和產(chǎn)物的合成，對微生物的發(fā)酵生產(chǎn)影響重大。

按照含碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)相等的原則，分別以麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘油、可溶性淀粉代替MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖（20 g/L）為碳源進(jìn)行單因素實驗。如圖1所示，H3對6種碳源的利用情況有所不同，最容易利用的是麥芽糖，其次是葡萄糖，而對其他碳源利用程度較差。但是，從原料的價格方面考慮，實驗采用比較價廉的葡萄糖作為H3增殖的碳源。

在葡萄糖作為惟一碳源的基礎(chǔ)上，選擇合適的葡萄糖質(zhì)量濃度至關(guān)重要。由圖2可知，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，活菌濃度呈先增加后降低的趨勢。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為40 g/L時，活菌濃度達(dá)到最高，為3.86×109CFU/mL。由圖2可知，適當(dāng)提高葡萄糖質(zhì)量濃度有利于菌體的生長，但是當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到40 g/L以上時，菌體的生長受限。

圖1 碳源對H3菌體濃度的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on the viable cell counts of H3

圖2 葡萄糖質(zhì)量濃度對H3菌體濃度的影響Fig.2 Effects of different concentrations of glucose on the viable cell counts of H3

2.1.2 氮源及其質(zhì)量濃度對H3菌體濃度的影響氮源是構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)的主要成分，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等和含氮代謝物等。按照上述碳源的研究方法，通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源來研究不同氮源對H3生長的影響。按照含氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)相等的原則（MRS培養(yǎng)基中含氮量為25 g/L），分別以蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、NH4Cl、（NH4）2SO4、NaNO3、尿素為氮源進(jìn)行單因素實驗。

如圖3所示，短乳桿菌對不同氮源的利用情況不同，對酵母粉利用較好，活菌數(shù)相應(yīng)較高，達(dá)到4.72×109 CFU/mL。在此基礎(chǔ)上對氮源濃度進(jìn)行考察，結(jié)果見圖4。當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度為30 g/L時，短乳桿菌活菌數(shù)最高，為4.84×109CFU/mL。

圖3 氮源對H3菌體濃度的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on the viable cell counts of H3

圖4 酵母粉質(zhì)量濃度對H3菌體濃度的影響Fig.4 Effects of different concentrations of yeast on the viable cell counts of H3

2.1.3 緩沖鹽及其質(zhì)量濃度對H3菌體濃度的影響在確定碳源、氮源及其質(zhì)量濃度后，研究了不同的緩沖體系和同一緩沖體系不同質(zhì)量濃度對H3生長的影響情況。由表1可見，在培養(yǎng)基中加入緩沖鹽比不加緩沖鹽的乳酸菌活菌數(shù)要明顯增多，其中，以檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖體系對菌體促生長效果最好，最高活菌濃度達(dá)到5.36×109CFU/mL。

2.1.4 生長因子及其質(zhì)量濃度對H3菌體濃度的影響

生長因子是微生物正常代謝必不可少且不能用簡單的碳源或氮源自行合成的有機(jī)物。維生素是第一類生長因子，大多數(shù)維生素是輔酶的組成成分。有些氨基酸也是多種微生物的生長因子，因此作者對補(bǔ)充維生素和氨基酸的效果進(jìn)行了研究。

在上述確定的培養(yǎng)基各組分基礎(chǔ)上分別補(bǔ)充了10 mg/L的B族維生素（包括VB1、VB2、VB5、VB6、VB9）與維生素C，補(bǔ)充了100 mg/L的精氨酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽，接種發(fā)酵測定菌體生長情況，結(jié)果見圖5。

表1 不同緩沖鹽體系培養(yǎng)基中的H3菌體濃度（x±SD，N=3）Table 1 Cell density of H3 in medium with different buffer salts（x±SD，N=3）

由圖5可知，添加不同種類的生長因子對H3活菌數(shù)具有一定影響。實驗選取對H3菌體增殖效果較好的VB6，進(jìn)一步其作為生長因子的最佳質(zhì)量濃度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見圖6。由圖6可知，VB6的添加量為20 mg/L時活菌濃度最大，達(dá)到5.62×109CFU/mL。

圖5 生長因子對H3菌體濃度的影響Fig.5 Effects of different growth factors on the viable cell counts of H3

圖6 VB6質(zhì)量濃度對H3菌體濃度的影響Fig.6 Effects of different concentrations of VB6on the viable cell counts of H3

2.1.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗 為綜合考察各因素對菌體生長的效果，選取在單因素試驗中增菌效果較明顯的3個因素（葡萄糖、酵母粉、檸檬酸緩沖鹽濃度）進(jìn)行正交實驗，每個因素選取兩個水平，優(yōu)化H3的最佳增菌培養(yǎng)基，實驗設(shè)計見表2。

表2 正交實驗方案設(shè)計Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

對正交試驗結(jié)果進(jìn)行極差分析，見表3。在本實驗范圍內(nèi)各指標(biāo)對活菌數(shù)的影響大小依次為：緩沖鹽質(zhì)量濃度＞葡萄糖質(zhì)量濃度＞酵母粉質(zhì)量濃度；較好的實驗方案應(yīng)該是：A2B2C2。采用此較優(yōu)組合的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵驗證，活菌數(shù)為6.10×109CFU/mL。即培養(yǎng)基最佳配方為：葡萄糖50 g/L，酵母粉 30 g/L，檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖鹽 0.08 mol/L，VB620 mg/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·5H2O 0.25 g/L，吐溫80 1 g/L。

表3 正交試驗極差分析結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment result analysis

2.2 培養(yǎng)條件的確定

2.2.1 培養(yǎng)溫度對H3菌體濃度的影響 溫度是影響菌體生物量積累的重要因素，不同微生物的最適生長溫度范圍也不同，在發(fā)酵過程中應(yīng)嚴(yán)格地控制培養(yǎng)溫度。作者比較了不同溫度條件下H3的生長情況，結(jié)果見圖7。由圖7可知，溫度對H3活菌數(shù)的影響較大，溫度過高過低都不利于其生長。在20、25、30、35、37℃下培養(yǎng)，菌體濃度達(dá)到最大，分別為4.57×109、5.24×109、6.10×109、5.12×109、4.79×109CFU/mL。因此，確定30℃為H3生長的最適溫度。

圖7 溫度對H3菌體濃度的影響Fig.7 Effects of different temperatures on the viable cell counts of H3

2.2.2 裝液量對H3菌體濃度的影響 溶氧是微生物進(jìn)行能量代謝最重要參數(shù)，通常是好氧發(fā)酵的限制性因素，不同微生物的生長對溶氧量有不同范圍的要求，而在其他培養(yǎng)條件都相同的情況下，不同的裝液量直接影響了液體培養(yǎng)基中氧溶解量。作者比較了不同裝液量對H3的生長情況的影響，結(jié)果見圖8。由圖8可知，以250 mL三角瓶進(jìn)行乳酸菌培養(yǎng)，不同的裝液量對乳酸菌體的生長有一定的影響，回轉(zhuǎn)速度200 r/min時，其中裝液量為40 mL/ 250 mL時菌體細(xì)胞數(shù)最多，裝液量超過40 mL時和低于40 mL時，菌體細(xì)胞數(shù)都有所降低。這可能是因為短乳桿菌為微好氧菌，培養(yǎng)基中維持一定的溶氧量會導(dǎo)致菌體的快速生長。因此，過多或過少的溶氧量都不利于菌體的生長繁殖，通過實驗可以得出40 mL/250 mL（回轉(zhuǎn)速度200 r/min）為培養(yǎng)H3最佳的搖瓶裝液量。

2.3 pH調(diào)節(jié)和補(bǔ)料培養(yǎng)

圖8 裝液量對H3菌體濃度的影響Fig.8 Effects of different quantity of medium on the viable cell counts of H3

2.3.1 加堿調(diào)節(jié)pH對H3菌體濃度的影響 乳酸菌在培養(yǎng)的過程中，其代謝產(chǎn)物中的乳酸等有機(jī)酸會引起培養(yǎng)液pH較大的變化，培養(yǎng)液pH過低會使乳酸菌自身的生長受到抑制。因此為了得到高密度的乳酸菌培養(yǎng)物，采用向培養(yǎng)液中添加適當(dāng)?shù)闹泻蛣瑢H值調(diào)節(jié)在一定范圍內(nèi)，部分消除了抑制乳酸菌生長的酸脅迫作用。試驗中，控制培養(yǎng)過程中pH值為5.3～4.8、5.8～5.3、6.3～5.8、6.8～6.3、7.3～6.8，分別選用 6 mol/L NaOH、20%NH3·H2O、20% Na2CO3、20% 檸檬酸鈉作為中和劑，30℃培養(yǎng)測定其活菌數(shù)，結(jié)果見圖9-10。

由圖9-10可知，添加中和劑使短乳桿菌最大活菌數(shù)有所提高，但活菌數(shù)達(dá)到最大值時的培養(yǎng)時間略有延長。由圖9可知，pH值對乳酸菌生長情況影響非常大，培養(yǎng)過程中pH值控制在6.8～6.3之間，獲得的活菌數(shù)最高。不在這個pH值范圍內(nèi)的乳酸菌生長的活菌數(shù)較低，特別是pH值控制在5.3～4.8內(nèi)的最低。由圖10可知，添加不同的中和劑對短乳桿菌的生長影響程度有所不同，以20%檸檬酸鈉作為中和劑影響效果最顯著，最大活菌數(shù)為8.93×108CFU/mL，比對照組提高8.5×107CFU/mL。綜合實驗結(jié)果，添加檸檬酸鈉最好，其次為Na2CO3和NH3·H2O，NaOH效果最差，這可能是因為NaOH作為強(qiáng)堿對乳酸菌生長有一定的抑制作用，因此，最后確定添加20%檸檬酸鈉溶液作為中和劑。

2.3.2 補(bǔ)料一定比例的碳源和氮源對L.brevis H3菌體濃度的影響

圖9 pH對發(fā)酵過程H3菌體濃度的影響Fig.9 Effects of pH on the viable cell counts of H3 during fermentation process

圖10 中和劑對發(fā)酵過程H3活菌數(shù)的影響Fig.10 Effects of different neutralizers on the viable cell counts of H3 during fermentation process

在高密度發(fā)酵過程中，菌體迅速繁殖需要大量的碳源和氮源作為其能量物質(zhì)，而作為分批發(fā)酵，過高質(zhì)量濃度的碳氮源會導(dǎo)致底物抑制效應(yīng)，不利于乳酸菌生物量的積累，所以在前面確定了最佳培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，分別進(jìn)行以下5種碳氮源補(bǔ)料方案（A、B、C、D、E）進(jìn)行培養(yǎng)：將碳氮源以5∶3比例混合均勻，培養(yǎng)基初始加入4%、8%、12%的一次性投料；初始4%，10 h后補(bǔ)料4%；初始4%，10 h和20 h后各補(bǔ)料4%。測定各培養(yǎng)液的活菌濃度，測得活菌數(shù)變化的結(jié)果見圖11。由圖11可知，一次性投料的A、B、C三個方案中，其中方案B的活菌數(shù)最高。另外D、E二種補(bǔ)料培養(yǎng)方案都比一次性投料方案要好，而且方案E測得活菌數(shù)比方案D要高8.3× 107CFU/mL。因此，培養(yǎng)基初始4%，10 h和20 h后各補(bǔ)料4%的碳氮源混合補(bǔ)料培養(yǎng)菌體，活菌數(shù)達(dá)到1.27×1010CFU/mL。

圖11 補(bǔ)料一定比例的碳氮源對發(fā)酵過程H3活菌數(shù)的影響Fig.11 Effects of feeding batch in specific C/N ratio on the viable cell counts of H3 during fermentation process

3 結(jié)語

以一株泡菜發(fā)酵專用的短乳桿菌H3為出發(fā)菌株進(jìn)行菌體高密度培養(yǎng)，適宜培養(yǎng)基配方為：葡萄糖25 g/L，酵母粉15 g/L，檸檬酸1.53 g/L，檸檬酸鈉18.58 g/L，VB620 mg/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·5H2O 0.25 g/L，Tween-80 1 g/L，在培養(yǎng)過程中使用20%檸檬酸鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值在6.8～6.3、培養(yǎng)溫度30℃、裝液量40 mL/250 mL，200 r/min回轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)，適宜補(bǔ)料培養(yǎng)方式為培養(yǎng)10 h和20 h時各補(bǔ)加4%的碳氮源（碳氮比為5∶3）。培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液中乳酸菌菌體活菌數(shù)可達(dá)1.27×1010CFU/mL，為目前報道的最高水平。本研究為短乳桿菌的泡菜工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[1]Ronka E，Malinen E，Saarela M，et al.Probiotic and milk technological properties of Lactobacillus brevis[J].International Journal of Food Microbiology，2003，83（1）：63-74.

[2]Nobuta Y，Inoue T，Suzuki S，et al.The efficacy and the safety of Lactobacillus brevis KB290 as a human probiotics[J]. International Journal of Probiotics and Prebiotics，2009，4（4）：263-70.

[3]Segawa S，Nakakita Y，Takata Y，et al.Effect of oral administration of heat-killed Lactobacillus brevis SBC8803 on total and ovalbumin-specific immunoglobulin E production through the improvement of Th1/Th2 balance[J].International Journal ofFood Microbiology，2008，121（1）：1-10.

[4]Della Riccia D，Bizzini F，Perilli M，et al.Anti-inflammatory effects of Lactobacillus brevis（CD2）on periodontal disease[J].Oral Diseases，2007，13（4）：376-385.

[5]Wiander B，Ryhanen E-L.Laboratory and large-scale fermentation of white cabbage into sauerkraut and sauerkraut juice by using starters in combination with mineral salt with a low NaCl content[J].European Food Research and Technology，2005，220（2）：191-195.

[6]Meignen B，Onno B，Gélinas P，et al.Optimization of sourdough fermentation with Lactobacillus brevis and baker's yeast[J]. Food microbiology，2001，18（3）：239-45.

[7]劉輝，季海峰，張董燕，等.飼糧添加短乳桿菌對生長豬生長性能和血清生化指標(biāo)的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2013，25（1）：182-189. LIU Hui，JI Haifeng，ZHANG Dongyan，et al.Effects of Lactobacillus brevis supplementation on growth performance，serum biochemical indices of growing pigs[J].Chinese Journal of Animal Nutrition，2013，25（1）：182-189.（in Chinese）

[8]Di Cagno R，Coda R，De Angelis M，et al.Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation[J].Food Microbiology，2013，33（1）：1-10.

[9]余文華，張其圣，陳功，等.直投式菌劑發(fā)酵泡菜的動態(tài)研究[J].食品與發(fā)酵科技，2010，46（6）：12-15. YU Wenhua，ZHANG Qisheng，CHEN Gong，et al.Study on dynamic changes during the fermentation of direct vat set pickles[J]. Food and Fermentation Technology，2010，46（6）：12-15.（in Chinese）

[10]劉振民.乳酸菌高密度培養(yǎng)及濃縮型發(fā)酵劑研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

[11]賀稚非，向瑞璽，李洪軍，等.泡菜活性直投式乳酸菌發(fā)酵劑的研究[J].食品科學(xué)，2006，27（8）：191-197. HE Zhifei，XIANG Ruixi，LI Hongjun，et al.Study on high effective lyophilized lactic acid direct vat starter culture concentrates in fermented vegetables[J].Food Science，2006，27（8）：191-197.（in Chinese）

[12]任亞妮，車振明，金建，等.短乳桿菌的培養(yǎng)條件及高密度培養(yǎng)研究[J].中國調(diào)味品，2011，36（6）：48-53. REN Yani，CHE Zhenming，JIN Jian，et al.Study on the cultivating conditions and proliferation od medium components of Lactobacillus brevis[J].China Condiment，2011，36（6）：48-53.（in Chinese）

Investigation on High Cell Density Cultivation of Lactobacillus brevis Specific for Vegetable Fermentation

ZHU Kongliang1，2， WU Dan1，2， WU Jing*1，2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In order to achieve the high cell density culture of Lactobacillus brevis H3，the effects of medium formula，culture conditions，neutralizers and feed batch methods on viable cell counts have been investigated.Suitable medium formulation are：25 g/L glucose，15 g/L yeast，1.53 g/L citric acid，18.58 g/L sodium citrate，20 mg/L VB6，0.58 g/L MgSO4·7H2O，0.25 g/L MnSO4·5H2O，1 g/L Tween-80.Optimal culture conditions are temperature 30℃，cultural fluid amount 40mL，pH 6.3～5.8，using 20%sodium citrate as neutralizer.Appropriate feeding culture method is 4%carbon and nitrogen sources（C/N ratio 5：3），which was added after 10 and 20 h，respectively.When fermented at the optimal culture conditions，the number of the bacteria cells was up to 1.27×1010CFU/mL，which was 7.5 times as high as that when it was not optimized.

Lactobacillus brevis，vegetable fermentation，high cell density cultivation

TS 201.3

A

1673—1689（2015）08—0828—07

2014-03-03

國家863計劃項目（2011AA100904）。

*通信作者：吳 敬（1969—），女，江蘇鎮(zhèn)江人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品與發(fā)酵工程方面的研究。E-mail：jingwu@jiangnan.edu.cn