黃永光， 徐 巖

（1.江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.釀酒科技雜志社，貴州 貴陽 550007）

醬香白酒釀造環(huán)境曲霉的分離及Aspergillus hennebergii酶分泌脅迫條件

黃永光1，2， 徐 巖*1

（1.江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.釀酒科技雜志社，貴州 貴陽 550007）

以茅臺鎮(zhèn)醬香白酒釀造過程關(guān)鍵環(huán)節(jié)樣品為載體，對曲霉的生態(tài)結(jié)構(gòu)分布進行分析；以新鮮麩皮為培養(yǎng)基模擬固態(tài)發(fā)酵方法對影響篩選優(yōu)勢菌株Aspergillums henneberguii的生長及分泌糖化酶、蛋白酶的主要發(fā)酵脅迫條件進行了分析。結(jié)果分離得到曲霉103株，分別鑒定為10個種屬種，即A.niger、A.oryzae、A.terreus、A.tubingensis、A.flavus、A.henneberguii、A.fumigatus、A.niveus、A.candidus和Monascus；發(fā)酵基質(zhì)初始水分在50%和初始pH在3.5～4.0條件下有利于Aspergillums henneberguii的生長和酶的分泌；Aspergillums henneberguii的適宜生長溫度范圍為30～35℃，酶分泌溫度為32～35℃；高乙醇體積質(zhì)量（＞8%）對Aspergillums henneberguii的生長和產(chǎn)酶存在抑制，低乙醇體積質(zhì)量（2%）反而有利于其生長和酶的分泌；（NH4）2SO4有利于Aspergillums henneberguii糖化酶的分泌，NaNO2和酵母浸膏有利于其生長和蛋白酶的分泌；乳糖和麥芽糖對Aspergillums henneberguii的生長和產(chǎn)酶有利，山梨糖、蔗糖、果糖可促進菌株糖化酶的分泌；單獨添加硫酸鈉有利于Aspergillums henneberguii的生長和酶的分泌；新鮮麩皮富含碳源、氮源、無機鹽、微量元素等，為Aspergillums henneberguii菌體生產(chǎn)及制酶的優(yōu)質(zhì)天然載體。Aspergillums henneberguii的應(yīng)用可滿足傳統(tǒng)固態(tài)白酒釀造過程的雙邊發(fā)酵和風(fēng)味形成機制需求。

醬香白酒釀造；曲霉生態(tài)分布；Aspergillus henneberguii；酶分泌；脅迫條件

傳統(tǒng)醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵獨特的釀造工藝經(jīng)過長期馴化形成了其獨特的微生態(tài)群落結(jié)構(gòu)[1-3]，其中曲霉菌起著舉足輕重的作用，除分泌多種主要功能酶類[4-5]，降解發(fā)酵原料中的淀粉和蛋白質(zhì)，促進原料降解利用外，還能代謝產(chǎn)生多種風(fēng)味成分[2-3，6]，賦予酒體風(fēng)味和醇厚感。如Aspergillums niger等曲霉菌能分泌糖化酶、蛋白酶等多種酶類以及有機酸等多種代謝產(chǎn)物[6]。A.niger等曲霉菌是固態(tài)發(fā)酵過程雙邊發(fā)酵機制的關(guān)鍵微生物，對發(fā)酵具有重要影響。由于研究技術(shù)手段、取樣方式及時間等條件限制，致使至今對其生態(tài)結(jié)構(gòu)和功能認識還不能實現(xiàn)全面的突破。已有報道表明，醬香型白酒釀造過程存在A.niger、A.oryzae、A.terreus、A.flavus、A.fumigatus、A.niveus和Monascus等曲霉[1-3，5-6]。

以茅臺鎮(zhèn)醬香白酒釀造過程關(guān)鍵工藝環(huán)節(jié)物料及其釀造環(huán)境樣品為載體，分析釀造過程曲霉生態(tài)結(jié)構(gòu)及其種類分布，并從固態(tài)發(fā)酵雙邊發(fā)酵機制調(diào)控著眼，重點分析了發(fā)酵脅迫條件對A. hennebergii的生長及其主要功能酶糖化酶、蛋白酶分泌的影響。對研究傳統(tǒng)固態(tài)法白酒釀造過程重要功能曲霉在一定程度上代替或改善微生物群落結(jié)構(gòu)，推進傳統(tǒng)釀造的純種糖化發(fā)酵的現(xiàn)代化發(fā)展和提高生產(chǎn)效率創(chuàng)新方法具有重要意義[7-8]。

1 材料與方法

1.1 樣品

根據(jù)已有對傳統(tǒng)固態(tài)法白酒釀造生態(tài)中微生物的研究報道[9-10]，選擇釀造大曲、酒醅、曲房稻草等載體作為曲霉菌分離源樣品，采集于貴州茅臺鎮(zhèn)MTGF、JSL、HXJY、LYCJY、XJGS等規(guī)模以上白酒生產(chǎn)企業(yè)正常生產(chǎn)過程。

1.2 主要試劑及儀器

試劑：硝酸鈉、碳酸氫銨、尿素、酵母膏、蛋白胨、可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、麩皮、蔗糖等試劑均為分析純，購自國藥集團。

孟加拉紅培養(yǎng)基（組分g/L）：蛋白胨 5.0，葡萄糖10.0，磷酸二氫鉀1.0，硫酸鎂0.5，瓊脂 20.0，孟加拉紅0.033，氯霉素0.1；121℃滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基（組分g/L）：馬鈴薯（去皮）200，瓊脂20.0，葡萄糖20.0，氯霉素 0.1；121℃滅菌20min。

麩曲培養(yǎng)基：稱取10 g新鮮麩皮于250 mL錐形瓶中，加水10 mL，121℃滅菌20 min。

菌株保存：挑取新鮮孢子，于裝有體積分數(shù)30%無菌甘油的EP管內(nèi)搖勻，-20℃冰箱保存。

PCR儀（PC300）：Eppendorf Master personal；電泳儀：美國Bio-rad；熒光定量PCR儀CFX96：美國Bio-rad；冷凍高速離心機3K15：美國Sigma-Aldrich公司；電熱恒溫水浴鍋：上海華連醫(yī)療器械有限公司；超低溫冰箱：Thermo Electron Corporation；酶標(biāo)儀：Thermo Electron Corporation；貝克曼Avanti J-E高效多用途離心機：美國Beckman有限公司；細胞破碎儀FastPrep H-24：美國MP-Biomedicals。

1.3 曲霉分離鑒定

曲霉菌的分離根據(jù)文獻[10]進行；計數(shù)方法根據(jù)GB/T 4789.15-2010方法[12-13]進行；菌株按文獻[10，14]方法進行鑒定。

1.4 發(fā)酵脅迫因子分析

1.4.1 初始水分對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響 以新鮮麩皮為培養(yǎng)基，初始水分含量分別控制體積質(zhì)量為35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%。

1.4.2 初始pH對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響 以新鮮麩皮為培養(yǎng)基，水分體積質(zhì)量50%，調(diào)節(jié)初始 pH分別為 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。

1.4.3 培養(yǎng)溫度對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響 以新鮮麩皮為培養(yǎng)基，含水體積質(zhì)量為50%，初始pH 4.0，培養(yǎng)溫度分別為25、30、35、40、45、50℃。

1.4.4 不同初始乙醇濃度對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響 以新鮮麩皮為培養(yǎng)基，含水體積質(zhì)量為50%，初始pH 4.0，分別按乙醇與發(fā)酵基質(zhì)體積質(zhì)量的2%、4%、6%、8%、10%加入無水乙醇進行實驗。

1.4.5 不同氮源對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響 以新鮮麩皮為培養(yǎng)基，含水體積質(zhì)量50%，初始pH 4.0，加入相應(yīng)氮源（質(zhì)量分數(shù)0.2%）。

1.4.6 不同碳源對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響 以新鮮麩皮為培養(yǎng)基，含水體積質(zhì)量50%，初始pH 4.0，加入相應(yīng)的碳源（質(zhì)量分數(shù)0.2%）。

1.4.7 不同無機鹽對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響 以新鮮麩皮為培養(yǎng)基，含水體積質(zhì)量50%，初始pH 4.0，加入相應(yīng)的無機鹽（鹽離子摩爾質(zhì)量濃度10 mmol/g）。

以上所有實驗均做3個平行實驗，培養(yǎng)基均經(jīng)121℃滅菌20 min，冷卻至室溫，按6.2×105個/g接種A.hennebergii，于30℃培養(yǎng)48 h，測定酶活和生物量[15]。

1.5 酶活及生物量測定

蛋白酶酶活測定：采用Folin-酚法，具體參照文獻[16]；糖化酶酶活：按Michael Somogyi的方法進行測定[17-18]；生物量的測定：采用熒光定量方法[14，19]；蛋白酶活力定義為：在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。糖化酶酶活定義為：在40℃下每分鐘水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖，定義為一個酶活力單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 茅臺鎮(zhèn)傳統(tǒng)醬香白酒釀造生態(tài)中的曲霉菌

根據(jù)曲霉菌在培養(yǎng)基上的不同生長形態(tài)特征，從樣品中共分離得曲霉菌103株。通過形態(tài)分類后對其ITS rDNA區(qū)域測序并在NCBI比對鑒定，所分離曲霉菌歸屬為10個菌種，即Aspergillums niger、Aspergillus oryzae、Aspergillus terreus、Aspergillus tubingensis、Aspergillus flavus、Aspergillus henneberguii、Aspergillus fumigatus、Aspergillus niveus、Aspergillus candidus和Monascus，見表1。

從表1可知，曲霉主要集中在制曲過程的第二次翻倉中前期曲胚、貯存期成品曲、堆積酒醅、曲房稻草中，而窖期發(fā)酵酒醅中相對較少。這可能與曲霉嗜低溫、高濕度、孢子易遷移、好氧等特征有關(guān)，同時也與被采樣企業(yè)的釀造環(huán)境生態(tài)、生產(chǎn)環(huán)境等分不開。一般年均氣溫偏高、濕度偏大、空氣流動速度相對較低的環(huán)境有利于曲霉的生長和富集。

作者分離得曲霉A.niger、A.oryzae、A.terreus、A. tubingensis、A.flavus、A.henneberguii、A.fumigatus、A. niveus、A.candidus，與已報道的茅臺酒釀造微生物研究[20-23]結(jié)果相比，存在一定的差異。其中，A.niger、A.oryzae、A.terreus、A.flavus、A.nidulans、A.henneberguii、Monascus主要存在于制曲環(huán)境，A.nidulans、A.fumigatus、A.flavus、Monascus、A.niger、A.oryzae、A.terreus、A.tubingensis、A.flavus、A.henneberguii、A.fumigatus多存在于制酒環(huán)境中；A.niger、A.oryzae、A.terreus、A.flavus、A.fumigatus多存在于空氣環(huán)境中。與以往研究報道不同的是，本次在多個企業(yè)采集樣品中均分離到 A.tubingensis、A.hennebergii，這與以往對茅臺酒釀造微生物研究結(jié)果是有所差異的。本次分離所得曲霉屬多樣性較豐富，體現(xiàn)了茅臺鎮(zhèn)作為中國傳統(tǒng)固態(tài)法醬香型白酒釀造微生態(tài)典型環(huán)境中曲霉的多樣性特征[24]，可能原因與采樣種類較豐富和茅臺鎮(zhèn)采集環(huán)境的特殊性有關(guān)，但本次未分離到文獻[20-23]報道的A.parasiticus，A.viridinutans、A.sydowii、A.wentti，這可能與采樣覆蓋面仍然未達到更全面的原因。本研究證實了A.niger、A.tubingensis、A.hennebergii、A.oryzae、A.terreus、A.fumigatus為茅臺鎮(zhèn)醬香白酒釀造環(huán)境中的優(yōu)勢曲霉。

表1 茅臺鎮(zhèn)醬香白酒釀造生態(tài)中的曲霉及其分布情況Table 1 Aspergillus and their distribution in Jiangxiang liquor fermentation environment in Maotai village

2.2 分離曲霉的主要功能酶分泌特性表征比較

對分離得曲霉中的發(fā)酵型主要功能酶分泌優(yōu)勢菌株進行麩曲培制，分析其分泌糖化酶、蛋白酶釀造功能酶特性并進行比較，其分泌酶酶活的比較分析結(jié)果見表2。

表2 部分分離優(yōu)勢曲霉菌株分泌糖化酶、蛋白酶特性比較結(jié)果Table 2 Characteristics of glucoamylase and protease secreted by some of the prodominant Aspergillus strains

從表2可知，A.niger、A.oryzae、A.tubingensis、 A.hennebergii分泌糖化酶的能力較強；A.niger、A. terreus、A.tubingensis、A.hennebergii、A.fumigatus分泌蛋白酶特性較好；從固態(tài)釀造發(fā)酵雙邊糖化機制衡量，A.niger、A.tubingensis、A.hennebergii最適宜傳統(tǒng)固態(tài)法白酒釀造生產(chǎn)應(yīng)用，其分泌糖化酶、蛋白酶的量及其酶活比例能較好滿足雙邊發(fā)酵和風(fēng)味形成需求，不會出現(xiàn)太高、太低的現(xiàn)象。同時，從白酒發(fā)酵環(huán)境的基態(tài)條件和釀造動力需求角度分析，A.niger、A.tubingensis、A.henneberguii分泌糖化酶、蛋白酶較其他曲霉分泌酶更能滿足傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)需求，其具有耐酸、耐溫和耐乙醇等性能[25-27]。A. hennebergii更具備了雙邊發(fā)酵的機理調(diào)控前提，可以創(chuàng)新性應(yīng)用于傳統(tǒng)固態(tài)法白酒發(fā)酵微生物生態(tài)體系與雙邊發(fā)酵功能調(diào)控中。

2.3 主要釀造脅迫因子對釀造功能酶分泌的影響表征

2.3.1 初始水分對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響 培曲過程通過曲胚中水和傳質(zhì)媒介共同作用改變營養(yǎng)、生物熱在曲胚內(nèi)部的分布并形成適宜的梯度，滿足微生物的生長。麩曲發(fā)酵的初始水分對A.hennebergii生長和分泌糖化酶、蛋白酶的影響結(jié)果見圖1。

圖1 初始水分體積分數(shù)對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of initial moisture content on the growth and enzyme production of A.hennebergii

圖1表明，初始水分體積質(zhì)量在40%～60%之間，A.hennebergii都能生長和實現(xiàn)酶的分泌，但最適生長水分體積質(zhì)量則為50%左右，生物量和蛋白酶的最高量均出現(xiàn)在水分體積質(zhì)量為50%時；水分體積質(zhì)量為55%時，糖化酶分泌相對滯后，但從糖化酶分泌量的趨勢分析，水分體積質(zhì)量超過55%后快速下降。綜合考慮，選擇50%的初始水分體積質(zhì)量更有利于A.hennebergii菌株的生長、產(chǎn)酶及酶活發(fā)揮。固態(tài)培曲發(fā)酵過程高水分容易產(chǎn)生曲的團燒和生酸，不利于生物量的形成和產(chǎn)酶，導(dǎo)致酶的分泌和生物量大幅度下降；低水分條件有利于初期曲胚含氧量的富集和培菌初期菌絲的快速生長，升溫快，但中后期保溫、保濕效果差，菌絲易老化，反而不利于菌的生長和酶的分泌。

2.3.2 初始pH對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響 曲霉在生長、代謝過程不但會產(chǎn)生一些酸類物質(zhì)，改變生態(tài)環(huán)境的酸度，同時其生長也受到環(huán)境酸度條件的脅迫，影響其生長和酶的分泌。在本研究設(shè)定初始pH條件下，A.hennebergii的生長及其酶分泌結(jié)果見圖2。

從圖2可知，隨著pH值的增加，曲品的酶活增加，適宜的產(chǎn)酶初始條件為：pH 3.5，蛋白酶酶活為459.63 U/g，生物量為2.31×107個/g；pH 4.0，糖化酶酶活為2 775.25 U/g。A.hennebergii酶活升高一方面與其生物量的增加有關(guān)，另一方面與酶的最適pH也有關(guān)。A.hennebergii只有在其最適宜的pH下才能實現(xiàn)生物量的最大富集，菌絲才能分泌大量的生物酶；同時只有在最適宜的pH下，酶的活性才能得到充分體現(xiàn)。在適宜的pH臨界點酶的分泌量和酶的活性都會受到影響。從圖2可知，A.hennebergii在新鮮麩皮載體上的最適產(chǎn)酶初始pH為3.5～4.0。

圖2 初始pH對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of initial pH on the growth and enzyme production of A.hennebergii

2.3.3 培養(yǎng)溫度對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響 不同的曲霉菌株對生長環(huán)境溫度的應(yīng)激性不一樣，導(dǎo)致其生長溫度和分泌酶的溫度范圍也不一樣。溫度對A.hennebergii生長及其酶分泌的影響見圖3。

圖3 培養(yǎng)溫度對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of temperature during starter culture on the growth and enzyme production of A.hennebergii

由圖3可知，菌株A.hennebergii的最適宜生長溫度范圍為30～35℃，實驗結(jié)果也表明其在28～40℃均能生長，超過40℃對菌體的生長速率產(chǎn)生一定的影響，但仍然能分化產(chǎn)孢；在45℃下生長速率停止，基本不生長、不產(chǎn)孢，菌體出現(xiàn)軟化、明顯的衰退和死亡現(xiàn)象。A.hennebergii的最適產(chǎn)酶溫度為32～34℃。

2.3.4 不同初始乙醇體積質(zhì)量對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響 A.hennebergii菌株分離篩選于白酒釀造過程，因此考察了不同初始乙醇體積質(zhì)量對菌株生長和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 初始乙醇體積質(zhì)量對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of initial alcohol content on the growth and enzyme production of A.hennebergii

從圖4可知，高乙醇體積質(zhì)量 （＞8%）對A.hennebergii的生長和產(chǎn)酶均存在抑制，低乙醇體積質(zhì)量（2%）有利于其生長和酶的分泌，其機制尚不完全清楚。高乙醇體積質(zhì)量對糖化酶的分泌影響較蛋白酶大，乙醇體積質(zhì)量超過8%后糖化酶的分泌呈現(xiàn)大幅度下降。乙醇體積質(zhì)量達到8%后菌株的生長放緩，菌體濃度下降，相應(yīng)條件下曲的酶活也呈現(xiàn)下降態(tài)勢。

2.3.5 不同氮源對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響 按1.4節(jié)所述氮源應(yīng)用方法進行實驗和分析，A.hennebergii的生長及產(chǎn)酶結(jié)果見圖5。

由圖5可看出，不同氮源對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶存在差異；生物量與酶的分泌存在一定的正相關(guān)，但不完全嚴格相關(guān)，（NH4）2SO4有利于糖化酶的分泌，NaNO2和酵母浸膏有利于菌株的生長和蛋白酶分泌。分析結(jié)果表明，空白樣即新鮮麩皮為載體培制麩曲，其菌株生物量與分泌主要釀造酶——糖化酶和蛋白酶與試驗應(yīng)用氮源效果相比，差異不大，麩皮完全可作為A.hennebergii生產(chǎn)菌體和制酶的優(yōu)質(zhì)天然載體。

2.3.6 不同碳源對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響 對A.hennebergii生長及酶分泌進行分析測定，結(jié)果見圖6。

圖6 碳源對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of carbon source on the growth and enzyme production of A.hennebergii

由圖6可看出，乳糖和麥芽糖對A.hennebergii的生長和產(chǎn)酶有利，山梨糖、蔗糖、果糖可促進其糖化酶的分泌，新鮮麩皮載體空白樣的生物量、酶分泌雖然在單一指標(biāo)上不是很高，但從糖化酶、蛋白酶整體分泌的趨勢上是有優(yōu)勢的，從傳統(tǒng)固態(tài)法白酒釀造過程的雙邊發(fā)酵和風(fēng)味形成機制上分析，新鮮麩皮作為載體是可以滿足的，其原因可能為新鮮麩皮富含碳源、氮源、無機鹽、微量元素等，能夠滿足A.hennebergii生長，但當(dāng)加入不同的單體營養(yǎng)成分時，由于其量的富集雖然可能一定程度上有利于生物量的積累，但同時也導(dǎo)致底物過剩，改變了酶分泌代謝途徑，影響胞外酶的富集，具體的代謝機制仍需進一步研究。

2.3.7 不同無機鹽對A.hennebergii生長及產(chǎn)酶的影響 按1.4節(jié)所述無機鹽設(shè)計方法進行實驗，A.hennebergii的生長及產(chǎn)酶結(jié)果見圖7。從圖7可知，在新鮮麩皮培養(yǎng)基中單獨添加不同的鉀、鈉、磷、鎂、鋅等鹽，對A.hennebergii的生長和產(chǎn)酶影響存在差異。整體結(jié)果比較而言，硫酸鈉有利于A.hennebergii的生長和酶的分泌，其次為空白新鮮麩皮；較空白新鮮麩皮的效果而言，部分鹽的添加還存在對菌生長和酶分泌的抑制現(xiàn)象，如NaCl、NH4NO3、KCl、NaH2PO4，就其原因可能為不同鹽離子濃度的富集在一定程度上改變了細胞膜的電荷平衡，從而影響其生長和細胞的通透性，一定程度上可能引起A.hennebergii酶分泌的代謝途徑及其胞質(zhì)的酶滲透性改變；同時，不同離子的富集在一定程度上也會導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境條件的改變，如pH條件、新鮮麩皮中營養(yǎng)因子被A.hennebergii利用的效率等，從而進一步影響了A.hennebergii的生物量和曲中糖化酶及蛋白酶的富集。

圖7 營養(yǎng)鹽對A.hennebergii的生長及產(chǎn)酶影響Fig.7 Effect of nutritional salts on the growth and enzyme production of A.hennebergii

3 結(jié)語

從醬香白酒釀造主要工藝環(huán)節(jié)及其釀造環(huán)境樣品中共分離曲霉103株，分別鑒定為10個種屬種，即 A.niger、A.oryzae、A.terreus、A.tubingensis、A.flavus、A.hennebergii、A.fumigatus、A.niveus、A.candidus和Monascus。糖化酶、蛋白酶分析結(jié)果表明，A.niger、A.tubingensis、A.hennebergii更適宜傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵的雙邊發(fā)酵機制，為釀造過程糖化酶、蛋白酶分泌優(yōu)勢菌株，特別是曲霉A.hennebergii。

發(fā)酵基質(zhì)初始水分在體積分數(shù)50%和初始pH在3.5～4.0條件下有利于A.hennebergii的生長和酶的分泌；A.hennebergii的適宜生長溫度范圍為30～35℃，酶分泌溫度為32～34℃；高乙醇體積質(zhì)量（＞8%）對A.hennebergii的生長和產(chǎn)酶存在抑制，對糖化酶的分泌影響較蛋白酶大，低乙醇體積質(zhì)量（2%）反而有利于其生長和酶的分泌。

氮源實驗結(jié)果表明，（NH3）4SO4有利于A.hennebergii糖化酶的分泌，NaNO2和酵母浸膏有利于其生長和蛋白酶的分泌；乳糖和麥芽糖對A.hennebergii的生長和產(chǎn)酶有利，山梨糖、蔗糖、果糖可促進菌株糖化酶的分泌。

在新鮮麩皮培養(yǎng)基中單獨添加硫酸鈉有利于A.hennebergii的生長和酶的分泌，其次為空白新鮮麩皮；新鮮麩皮富含碳源、氮源、無機鹽、微量元素等，為A.hennebergii菌體生產(chǎn)及制酶的優(yōu)質(zhì)天然載體，能滿足傳統(tǒng)固態(tài)白酒釀造過程的雙邊發(fā)酵和風(fēng)味形成機制需求。

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Isolation of Aspergillus from Jiangxiang Liquor Fermentation Environment and Enzyme Secretion Stress Conditions of Aspergillus hennebergii

HUANG Yongguang1，2， XU Yan*1
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Liquor-Making Science&Technology Publishing House，Guiyang 550007，China）

The ecological distribution of Aspergillus in the samples obtained at the key points of Jiangxiang liquor fermentation process in Maotai village and the effect of solid fermentationsimulated by fresh bran medium on the growth of predominant strain Aspergillums hennebergii and the main stress conditions of glucoamylase and protease secretion were analyzed in this paper.One hundred and three strains were obtained and identified as A.niger，A.oryzae，A.terreus，A.tubingensis，A.flavus，A.hennebergii，A.fumigatus，A.niveus，A.candidus and Monascus，respectively.The suitable conditions for the growth and protease secretion of Aspergillums hennebergii were 50%water content of the fermentation substrate and the pH value of 3.5-4.0.The suitable growth temperature of Aspergillums hennebergii was 30～35℃，whereas the suitable enzyme secretion temperature was 32～35 ℃.High alcohol contents（＞8%，v/w）inhibited the growth and enzyme secretion of Aspergillums hennebergii，while low alcohol contents（2%，v/w），lactose，and maltose promoted its growth and enzyme secretion.The salt of（NH3）4SO4and NaNO2and yeast could promote its growth，glucoamylase and protease secretion.Moreover，sorbose，sucrose and fructose could promote its glucoamylse secretion.The individual addition of sodium sulphate could promote its growth and enzyme production.Fresh bran，which was rich in carbon source，nitrogen source，inorganic salts and trace elements，could provide high-quality natural carrier for Aspergillums hennebergii growth and enzyme production.The application of Aspergillums hennebergii can satisfy the need of bilateral fermentation and flavor forming mechanism in traditional solid fermentation of liquor.

Jiangxiang liquor fermentation，ecological distribution of Aspergillus，Aspergillus hennebergii，enzyme secretion，stress conditions

TS261.1

A

1673—1689（2015）08—0814—08

2014-09-11

國家863計劃重點項目（2012AA021301）；國家支撐計劃重點項目（2008BAI63B06）；中國白酒169計劃項目。

黃永光（1976—），男，貴州石石千人，工學(xué)博士，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事釀酒科學(xué)與產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟、政策分析方面的研究。E-mail：gzhyg_03@163.com

*通信作者：徐 巖（1962—），男，浙江慈溪人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事釀酒科學(xué)與酶技術(shù)方面的研究。E-mail：yxu@jiangnan.edu.cn