劉金彬， 沈建增， 蔡宇杰*， 廖祥儒， 羅軍俠， 張大兵

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；3江蘇漢邦科技有限公司，江蘇 淮安223001）

蛹蟲(chóng)草Cordyceps militaris JN168菌株的誘變育種及液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草素

劉金彬1，2， 沈建增3， 蔡宇杰*1，2， 廖祥儒1，2， 羅軍俠3， 張大兵3

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；3江蘇漢邦科技有限公司，江蘇 淮安223001）

利用離子束、亞硝基胍及離子束-亞硝基胍誘變法處理蛹蟲(chóng)草Cordyceps militaris JN168，初步獲得了幾株較高產(chǎn)蟲(chóng)草素的菌株。通過(guò)進(jìn)一步篩選得到復(fù)合誘變菌2，并對(duì)該菌的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：蛹蟲(chóng)草液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草素的最佳培養(yǎng)基組分為（g/L），葡萄糖40，酵母浸粉25，MgSO4·7H2O 0.6，K2HPO4·3H2O 0.6，KH2PO40.6。優(yōu)化后蟲(chóng)草素產(chǎn)量提高了5倍，最高達(dá)1 045.65 mg/L。

蛹蟲(chóng)草；蟲(chóng)草素；誘變；液態(tài)發(fā)酵；優(yōu)化

蛹蟲(chóng)草是中國(guó)名貴的中藥，是一類(lèi)極具保健功能的大型藥用真菌，屬于真菌界、真菌門(mén)、子囊菌亞門(mén)、糞殼菌綱、肉座菌目、麥角菌科、蟲(chóng)草屬[1]，是蟲(chóng)草屬的模式種，學(xué)名為Cordyceps militaris，又名北冬蟲(chóng)夏草、北蟲(chóng)草[2]。近來(lái)大量文獻(xiàn)報(bào)道，蛹蟲(chóng)草可產(chǎn)多種活性物質(zhì)，像蟲(chóng)草素、甘露醇、蟲(chóng)草多糖等[3-4]。蟲(chóng)草素作為主要有效成分引起了人們的高度重視。

蟲(chóng)草素又名蟲(chóng)草菌素、3′-脫氧腺苷等，是第一個(gè)從真菌中分離出來(lái)的核苷類(lèi)抗生素[3]。1951年，Cunningham等觀察到被蛹蟲(chóng)草寄生的昆蟲(chóng)組織不易腐爛，隨后從中分離到蟲(chóng)草素。蟲(chóng)草素分子式為C10H13N5O3，相對(duì)分子質(zhì)量為251，熔點(diǎn)為230～231℃，溶于水、熱乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，紫外光的最大吸收波長(zhǎng)為259 nm[5-6]。很長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蟲(chóng)草素的藥理作用和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)研究具有極高的興趣。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，蟲(chóng)草素對(duì)DNA和RNA合成、hnRNA和mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾以及腺苷酸環(huán)化酶等均具有抑制作用，具有抗炎、抗真菌、抗癌及抗病毒等多種生理活性[9]。1997年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)美國(guó)波士頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行蟲(chóng)草素治療急性淋巴性白血病和慢性粒細(xì)胞白血病的一期臨床試驗(yàn)[4]；2008年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)美國(guó)OncoVista公司進(jìn)行蟲(chóng)草素與腺苷脫氨酶抑制劑噴司他丁聯(lián)合用藥，治療末端脫氧核苷酸陽(yáng)性白血病細(xì)胞（TDT+）的一期、二期臨床試驗(yàn)。目前，由蟲(chóng)草素制成的抗白血病的新藥已經(jīng)進(jìn)入三期臨床。

目前蟲(chóng)草素的生產(chǎn)主要有化學(xué)合成和生物合成兩種方法[7]。與生物合成法相比，化學(xué)合成蟲(chóng)草素得率低，合成過(guò)程中使用了大量有機(jī)溶劑（如氯仿等），對(duì)環(huán)境會(huì)造成污染等缺陷。蛹蟲(chóng)草發(fā)酵合成蟲(chóng)草素有寄主培養(yǎng)、固態(tài)培養(yǎng)、代料栽培和液體培養(yǎng)等多種方式。固態(tài)培養(yǎng)過(guò)程，蛹蟲(chóng)草產(chǎn)生的蟲(chóng)草素有98%從菌絲體分泌到周?chē)陌l(fā)酵培養(yǎng)基中[8]，因而液態(tài)發(fā)酵對(duì)于生產(chǎn)蟲(chóng)草素具有明顯優(yōu)勢(shì)。作者對(duì)蛹蟲(chóng)草進(jìn)行了亞硝基胍-離子束的復(fù)合誘變育種，并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期提高蟲(chóng)草素產(chǎn)量，促進(jìn)蟲(chóng)草素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 蛹蟲(chóng)草Cordyceps militaris JN168：保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO：M2011333。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）斜面培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母浸膏10，MgSO4·7H2O 1.0，K2HPO4·3H2O 0.5，KH2PO40.5，瓊脂20；pH自然，121℃滅菌20 min。

2）種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30，酵母浸膏10，MgSO4·7H2O 1.0，K2HPO4·3H2O 1.0，KH2PO41.0；pH自然，121℃滅菌20 min。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖40，酵母浸粉10，MgSO4·7H2O 1.0，K2HPO4·3H2O 1.0，KH2PO41.0；pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 誘變劑的配制 準(zhǔn)確稱取500 mg 1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（NTG），放入干凈燒杯中，先加入5 mL丙酮或甲酰胺進(jìn)行溶解，然后加入95 mL、pH 6.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液，配制成5 mg/mL的溶液。

1.2.2 孢子懸液的制備 將菌株 Cordyceps militaris JN168接種在種子斜面培養(yǎng)基，在25℃培養(yǎng)6～7 d，加入13 mL、pH 6.0的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子或用移液槍吹打下孢子（盡量不要弄下菌絲體）[12]，將孢子懸液倒入無(wú)菌試管，用無(wú)菌磷酸緩沖液適量稀釋制成OD600值在0.6～0.8之間的孢子懸液。

1.2.3 NTG誘變 取一定量5.0 mg/mL的NTG溶液，分別稀釋成1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL各1.5 mL。從不同質(zhì)量濃度的NTG溶液中，各取0.5 mL加入到4個(gè)無(wú)菌離心管，并標(biāo)記為1號(hào)。重復(fù)2次以上實(shí)驗(yàn)，分別標(biāo)記為2號(hào)、3號(hào)。然后取3個(gè)滅菌離心管各加0.5 mL磷酸緩沖液作為對(duì)照。在15個(gè)離心管中各加0.5 mL孢子懸液。將1號(hào)及一個(gè)對(duì)照在30℃下振蕩10 min，將2號(hào)及一個(gè)對(duì)照在30℃下振蕩20 min，剩下的3號(hào)及對(duì)照處理30 min。時(shí)間到達(dá)后，立即稀釋一定倍數(shù)停止藥品作用，然后涂平板，并在25℃下培養(yǎng)4 d并計(jì)數(shù)。

1.2.4 離子束誘變 在超凈工作臺(tái)中，分別取9片金屬載片置于酒精燈外焰灼燒30 s，待冷卻后放到滅菌的玻璃平板中，取20 μL孢子懸液涂在金屬載片上。將裝有樣品載片的平板移至ARTP誘變系統(tǒng)操作倉(cāng)，用無(wú)菌鑷子將載片放在相應(yīng)孔位，調(diào)節(jié)載片臺(tái)下方旋鈕，使載片處于氣流端口3 mm處，并關(guān)閉操作倉(cāng)門(mén)。在其他參數(shù)一定的條件下，分別把處理時(shí)間設(shè)定為0、6、8、10、12、14、16、18、20 s。待樣品處理完畢后，用無(wú)菌鑷子將載片放至裝有1 mL磷酸緩沖液的滅菌離心管中。將離心管放在振蕩器上振蕩3 min，形成新的孢子懸液。對(duì)新的孢子懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取100 μL稀釋液涂布平板，并在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后計(jì)數(shù)。

1.2.5 復(fù)合誘變 挑選出經(jīng)亞硝基胍誘變后的高產(chǎn)菌株，用1.2.4的方法進(jìn)行再次誘變。

1.2.6 致死率的計(jì)算 平板培養(yǎng)4 d后，小的菌落已經(jīng)長(zhǎng)成，拿出平板在光亮處數(shù)平板菌落數(shù)，并記下菌落數(shù)目，按照下列公式算出致死率。

1.2.7 誘變菌株穩(wěn)定性檢測(cè) 選擇菌落邊緣整齊，表面光滑，菌絲緊密，色澤光亮，顏色呈現(xiàn)橘紅色、金黃色的菌株[10-11]，洗下孢子經(jīng)行培養(yǎng)皿培養(yǎng)，再?gòu)闹刑暨x，然后反復(fù)傳代實(shí)驗(yàn)，直到選出形態(tài)、顏色穩(wěn)定的菌株，之后進(jìn)行搖瓶檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定的菌株可以作為種子菌株進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 液態(tài)發(fā)酵 按1.2.2制好的孢子懸液，以體積分?jǐn)?shù)10%接種于種子培養(yǎng)基中，25℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)4 d，獲得種子培養(yǎng)液。然后，按體積分?jǐn)?shù)10%接種，將種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶裝液50 mL，培養(yǎng)溫度25℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)周期8 d。

1.2.9 生物量的測(cè)定 通過(guò)真空泵將得到的發(fā)酵液進(jìn)行抽濾處理，收集濕菌體，置于60℃下恒溫干燥至恒重，用分析天平稱質(zhì)量。

1.2.10 蟲(chóng)草素濃度的測(cè)定 將1.2.8抽濾下來(lái)的發(fā)酵液以10 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，經(jīng)0.45 μm纖維濾膜過(guò)濾，除掉一些雜質(zhì)，然后用高效液相色譜法測(cè)定蟲(chóng)草素質(zhì)量濃度。檢測(cè)條件：紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，流動(dòng)相為 15%的甲醇，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30℃，流速1 mL/min[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變菌株生長(zhǎng)特性研究

從多次誘變實(shí)驗(yàn)中，選擇幾株長(zhǎng)勢(shì)良好，具有代表性的菌株，對(duì)其生長(zhǎng)情況進(jìn)行進(jìn)一步研究。原始菌株生長(zhǎng)緩慢，且不穩(wěn)定，容易退化，最主要的是蟲(chóng)草素的產(chǎn)量并不是很理想。經(jīng)過(guò)幾天的光照培養(yǎng)，原始菌株及誘變菌的平板長(zhǎng)勢(shì)見(jiàn)圖1。

圖1 蛹蟲(chóng)草Cordyceps militaris JN168原菌及誘變菌14-3、1-16、2-18、復(fù)合誘變2的平板形態(tài)特性Fig.1 Morphological character of Cordyceps militaris JN168 on plate(a)and mutant strains(b、c、d、e、f)

圖1中各圖片顯示了不同菌在轉(zhuǎn)色后的顏色及形態(tài)特征（各圖片皆是轉(zhuǎn)色穩(wěn)定時(shí)拍攝）?？梢钥闯觯T變后菌株的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況發(fā)生很大的差異。誘變菌14-3和誘變菌1-16的形態(tài)發(fā)生略微差異，但是顏色變化有很大差異。然而，誘變菌2-18和復(fù)合誘變菌2菌株的形態(tài)和顏色變化都很大，尤其是形態(tài)變化，兩株菌在平板中都長(zhǎng)出很高的子實(shí)體，顏色由原菌的橘黃色變?yōu)殚偌t色。誘變菌8-1是典型的負(fù)突變菌株，顏色變?yōu)榘咨x(chóng)草素產(chǎn)量也會(huì)很低。所以轉(zhuǎn)色后為白色或形態(tài)畸變的初篩時(shí)舍棄。

2.2 誘變菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草素的質(zhì)量濃度驗(yàn)證

2.2.1 NTG誘變菌株產(chǎn)蟲(chóng)草素質(zhì)量濃度測(cè)定 經(jīng)過(guò)多次傳代后，選出長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，接種于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，待其長(zhǎng)滿斜面后，制成孢子懸液，進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，誘變菌蟲(chóng)草素的產(chǎn)量基本上比原菌低，原菌產(chǎn)量為203.57 mg/L，但誘變菌株1-16的產(chǎn)量為289.29 mg/L，比原菌提高85.72 mg/L。誘變菌1-16轉(zhuǎn)色比原菌深，所以選擇誘變菌1-16進(jìn)一步進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

圖2 NTG誘變菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草素的質(zhì)量濃度Fig.2 Production of cordycepin by NTG mutant strain in liquid fermentation

2.2.2 第二次NTG誘變菌株產(chǎn)蟲(chóng)草素質(zhì)量濃度測(cè)定 在第一次實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，選擇更佳的誘變濃度及誘變時(shí)間進(jìn)行處理。涂平板并進(jìn)行培養(yǎng)。待菌落轉(zhuǎn)色后，挑出轉(zhuǎn)色好的菌株繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)數(shù)代、數(shù)十代的傳代培養(yǎng)，挑出穩(wěn)定的菌株進(jìn)行搖瓶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，誘變菌2-18蟲(chóng)草素的產(chǎn)量遠(yuǎn)高于原菌產(chǎn)量。誘變菌2-18的產(chǎn)量達(dá)553.51 mg/L，而原菌產(chǎn)量只有300.72 mg/L，所以選擇誘變菌2-18進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.2.3 離子束誘變菌株產(chǎn)蟲(chóng)草素濃度測(cè)定 ARTP（常壓室溫等離子體）技術(shù)是使用氦氣作為工作氣體，通過(guò)射頻輝光放電產(chǎn)生富含各種高能活性粒子的等離子體。ARTP所產(chǎn)生的活性粒子能夠?qū)?、植株、?xì)胞等的遺傳物質(zhì)造成損傷，并誘發(fā)生物細(xì)胞啟動(dòng)SOS修復(fù)機(jī)制。SOS修復(fù)過(guò)程為一種高容錯(cuò)率修復(fù)，因此修復(fù)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生種類(lèi)豐富的錯(cuò)配位點(diǎn)，并最終穩(wěn)定遺傳進(jìn)而形成突變株。ARTP對(duì)生物的遺傳物質(zhì)損傷效果明顯、損傷機(jī)制豐富、尤其是對(duì)于真核生物的遺傳物質(zhì)均有很強(qiáng)的損傷效果。離子束處理時(shí)間和孢子死亡率關(guān)系見(jiàn)圖4。

圖3 NTG誘變菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草素的質(zhì)量濃度Fig.3 Production of cordycepin by NTG mutant strain in liquid fermentation

圖4 蛹蟲(chóng)草Cordyceps militaris JN168離子束處理時(shí)間與死亡率的關(guān)系Fig.4 Relationship between ion beam processing time and death rate of Cordyceps militaris JN168

從圖4可以看出，隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，孢子的死亡率也不斷增加。當(dāng)處理時(shí)間為14 s時(shí)，孢子的死亡率達(dá)78%，在16、18 s時(shí)，孢子死亡率幾乎不再改變。當(dāng)超過(guò)18 s時(shí)，孢子死亡率頓時(shí)提高，幾乎全部死亡。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，產(chǎn)量形狀的誘變育種傾向于致死率70%～80%，因此選擇14 s為最佳處理時(shí)間。

因?yàn)橹滤狼€只能作為一種參考，所以在14 s左右多選擇幾個(gè)處理時(shí)間。誘變后的菌株經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后，進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖5。原菌產(chǎn)量為203.57 mg/L，并且有4株菌高于原菌產(chǎn)量，產(chǎn)量最高的為誘變菌14-3，其產(chǎn)量為362.62 mg/L，高于原菌產(chǎn)量159.05 mg/L，所以選擇誘變菌14-3作為這次誘變的目的菌株，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖5 離子束誘變菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草素的質(zhì)量濃度Fig.5 Production of cordycepin by ion beam mutant strain in liquid fermentation

2.2.4 復(fù)合誘變菌株產(chǎn)蟲(chóng)草素濃度驗(yàn)證 復(fù)合誘變利用兩種原理不同的誘變方法，先后對(duì)菌株進(jìn)行誘變，在菌株自我修復(fù)的過(guò)程中，再對(duì)誘變菌株進(jìn)行誘變。在整個(gè)誘變過(guò)程中，菌株遺傳物質(zhì)的損傷加大，生物細(xì)胞SOS修復(fù)更加紊亂，致使菌株的死亡率提高，存活下來(lái)的菌株在培養(yǎng)過(guò)程出現(xiàn)正突變的幾率變大。所以，誘變菌株更有可能高于原菌產(chǎn)量。經(jīng)過(guò)多次分離、純化，得到復(fù)合誘變菌2等幾株菌，如圖1（e）所示。

原始菌株在平板及其他器皿培養(yǎng)過(guò)程中，很少會(huì)出現(xiàn)子實(shí)體。而且子實(shí)體的產(chǎn)生，在大多數(shù)情況下需要溫差刺激。然而，復(fù)合誘變菌2并不需要溫差刺激，并且子實(shí)體的產(chǎn)生時(shí)間稍微縮短。將菌株接種于斜面，培養(yǎng)至長(zhǎng)滿斜面為止。然后制成孢子懸液進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6。發(fā)酵8 d后，原菌產(chǎn)量為231.62 mg/L，復(fù)合誘變菌2的產(chǎn)量高達(dá)620.74 mg/L，選擇復(fù)合誘變菌2繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

將得到的4株誘變菌進(jìn)一步分離、純化，在各代培養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵后產(chǎn)蟲(chóng)草素的情況見(jiàn)圖7。誘變菌1-16和誘變菌14-3在多次傳代過(guò)程中，蟲(chóng)草素產(chǎn)量表現(xiàn)并不是很穩(wěn)定，分別在250 mg/L和300 mg/L左右徘徊。誘變菌2-18的蟲(chóng)草素產(chǎn)量變化很不穩(wěn)定，不宜進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。復(fù)合誘變菌2的蟲(chóng)草素產(chǎn)量相當(dāng)穩(wěn)定，產(chǎn)量維持在600 mg/L左右，可以作為目的菌株，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖6 復(fù)合誘變菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草素的質(zhì)量濃度Fig.6 Production of cordycepin by compound mutation strain in liquid fermentation

圖7 誘變菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草素的穩(wěn)定性Fig.7 Stability study of liquid fermentation to produce cordycepin by mutant strains

2.3.1 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)Cordyceps militaris JN168菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)蟲(chóng)草素質(zhì)量濃度的影響

葡萄糖作為還原糖的一種，也是培養(yǎng)基主要的碳源之一。對(duì)菌體的生長(zhǎng)有重要的作用，而且對(duì)該菌產(chǎn)物蟲(chóng)草素的影響更為明顯。將發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度設(shè)為20、30、40、50、60 mg/mL，進(jìn)行不同質(zhì)量濃度的葡萄糖對(duì)Cordyceps militaris JN168產(chǎn)菌體和蟲(chóng)草素的實(shí)驗(yàn)。由圖8可以看出，葡萄糖質(zhì)量濃度為40 mg/mL時(shí)，蟲(chóng)草素質(zhì)量濃度最高，達(dá)732.24 mg/L。隨葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，菌體質(zhì)量濃度也不斷增加，但在葡萄糖質(zhì)量濃度為50 mg/mL時(shí)，菌體質(zhì)量濃度達(dá)到最大。

圖8 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)蛹蟲(chóng)草菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)蟲(chóng)草素的影響Fig.8 Effect of maltose concentration on cell growth and the production of cordycepin

2.3.2 酵母浸粉質(zhì)量濃度對(duì) Cordyceps militaris JN168菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)蟲(chóng)草素的影響 酵母浸粉作為重要的氮源，對(duì)菌株的生長(zhǎng)也是不可或缺，對(duì)實(shí)驗(yàn)中菌體的產(chǎn)物也尤為重要。設(shè)定培養(yǎng)基中酵母浸粉質(zhì)量濃度為10、15、20、25、30、35、40、45 mg/mL，進(jìn)行不同質(zhì)量濃度的酵母浸粉對(duì)Cordyceps militaris JN168產(chǎn)菌體和蟲(chóng)草素的影響實(shí)驗(yàn)。由圖9可以看出，酵母浸粉質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，蟲(chóng)草素質(zhì)量濃度最高。菌體質(zhì)量濃度與蟲(chóng)草素的產(chǎn)量并沒(méi)有確定的關(guān)系，菌體質(zhì)量濃度也并不是很有規(guī)律。從圖9可以看出，菌體質(zhì)量濃度取得最高值時(shí)，酵母浸粉質(zhì)量濃度為30 mg/mL。

圖9 酵母浸粉質(zhì)量濃度對(duì)蛹蟲(chóng)草菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)蟲(chóng)草素的影響Fig.9 Effect of yeast extract powder concentration on cell growth and the production of cordycepin

2.3.3 硫酸鎂質(zhì)量濃度對(duì)Cordyceps militaris JN168菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)蟲(chóng)草素的影響 鎂離子是許多重要酶（己糖激酶、檸檬酸脫氫酶、羧化酶等）的激活劑，能促進(jìn)碳水化合物的新陳代謝、磷酸鹽的轉(zhuǎn)化等，其水平與細(xì)胞內(nèi)聚胺水平相關(guān)，從而影響核糖體穩(wěn)定性和RNA合成。過(guò)多的鎂離子反而對(duì)菌體的生長(zhǎng)及產(chǎn)物的形成有抑制作用。所以，合適的鎂離子質(zhì)量濃度對(duì)菌體的產(chǎn)物尤為重要。將培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度設(shè)定為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，進(jìn)行不同質(zhì)量濃度的MgSO4·7H2O對(duì)Cordyceps militaris JN168產(chǎn)菌體和蟲(chóng)草素的影響實(shí)驗(yàn)。由圖10可以看出，MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時(shí)，蟲(chóng)草素質(zhì)量濃度最高，最高時(shí)達(dá)到879.27 mg/L。菌體質(zhì)量濃度在MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)最大，達(dá)到33 mg/mL。

圖10 MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度對(duì)蛹蟲(chóng)草菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)蟲(chóng)草素的影響Fig.10 Effect of MgSO4·7H2O concentration on cell growth and the production of cordycepin

2.3.4 磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀濃度對(duì)Cordyceps militaris JN168菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)蟲(chóng)草素的影響K2HPO4·3H2O和 KH2PO2不僅提供磷離子和鉀離子，而且對(duì)培養(yǎng)液的pH有一定的影響，所以K2HPO4·3H2O和KH2PO2合適的質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成尤為重要。選取K2HPO4·3H2O和KH2PO2的質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL進(jìn)行試驗(yàn)。由圖11可以看出，在K2HPO4· 3H2O和KH2PO2質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時(shí)，蟲(chóng)草素產(chǎn)量最高，達(dá)1 045.65 mg/L，但菌體質(zhì)量濃度最低。當(dāng)K2HPO4·3H2O和KH2PO2質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL，菌體濃度最高，達(dá)23.36 mg/mL。

3 結(jié)語(yǔ)

蟲(chóng)草素具有抗癌、抗白細(xì)胞、抗菌等多種生物活性和豐富的藥用價(jià)值，由于蟲(chóng)草的天然資源有限，人工生產(chǎn)蟲(chóng)草素已經(jīng)迫在眉睫。目前蟲(chóng)草素的生產(chǎn)主要是化學(xué)合成和生物合成兩種方法。然而，化學(xué)合成多采用一些有機(jī)溶劑，不但對(duì)產(chǎn)物有一定的影響，而且還會(huì)污染環(huán)境，因此生物合成就有了不可比擬的優(yōu)勢(shì)。盡管如此，生物合成還是有一些弊端難以克服，像產(chǎn)量低、周期長(zhǎng)等。所以提高產(chǎn)量和縮短周期就成了科研人員及工作人員亟待解決的難題。

圖11 K2HPO4·3H2O和KH2PO4質(zhì)量濃度對(duì)蛹蟲(chóng)草菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)蟲(chóng)草素的影響Fig.11 Effect of K2HPO·43H2O and KH2PO4concentration on cell growth and the production of cordycepin

本研究經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，得出以下幾項(xiàng)結(jié)論：

1）通過(guò)誘變育種和多次傳代培養(yǎng)，得到兩株比較有價(jià)值的菌株誘變菌14-3和復(fù)合誘變菌2。

2）通過(guò)優(yōu)化得到最優(yōu)培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母浸粉25 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，K2HPO4·3H2O 0.6 g/L，KH2PO40.6 g/L。

3）在不添加前體物質(zhì)，發(fā)酵時(shí)間8 d的條件下，得到蟲(chóng)草素產(chǎn)量為1 045.65 mg/L，與岳翠翠等報(bào)道的633.47 mg/L相比，提高了412.18 mg/L[12]。

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Mutation Breeding and Cordycepin Production Study of Cordyceps militaris JN168

LIU Jinbin1，2， SHEN Jianzeng3， CAI Yujie*1，2， LIAO Xiangru1，2， LUO Junxia3， ZHANG Dabing3
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Hanbon Science and Technology Co. Ltd，Huaian 223001，China）

Cordycepin is the major effective component of Cordyceps militaris，which is getting more and more attention for its hygienic and medical effects.In this study，we obtained several strains with high cordycepin yield from Cordycepsmilitaris JN168 by using ion beam，nitrosoguanidine and ion beam-nitrosoguanidine mixed mutation.After further screened，the high yield compound mutation strain 2 was obtained.Furthermore，the liquid medium composition of this strain was optimized for the fermentation of cordycepin.The results showed that the components of optimized medium were as follows：glucose 40 g/L，yeast extract 25 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，K2HPO4·3H2O 0.6 g/L，KH2PO40.6 g/L.With this optimized medium，the yield of cordycepin increased 5 times，reaching 1 045.65 mg/L.

Cordyceps militaris，cordycepin，mutation，liquid fermentation，optimization

TQ 920.1

A

1673—1689（2015）08—0806—08

2014-03-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21275066）。

*通信作者：蔡宇杰（1973—），男，江蘇無(wú)錫人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事生物工程方面的研究。E-mail：yjcai@jiangnan.edu.cn