陳星奕， 宿玲恰， 吳 敬*

（1．食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2．江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

重組大腸桿菌產(chǎn)Bacillus subtilis 168來源γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的搖瓶發(fā)酵優(yōu)化

陳星奕1，2， 宿玲恰1，2， 吳 敬*1，2

（1．食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2．江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

為實現(xiàn)來源于Bacillus subtilis的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）高效胞外分泌表達(dá)，以基因工程菌E.coli BL21（DE3）/pET-20b（+）/ggt為出發(fā)菌株，對其發(fā)酵產(chǎn)酶的誘導(dǎo)條件和培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。最終確定其最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為：10 g/L甘油，21 g/L酵母粉，7 g/L蛋白胨，130 mmol/L磷酸鹽；發(fā)酵條件為：37℃、200 r/min培養(yǎng)4 h，加入0.2 mmol/L IPTG后轉(zhuǎn)入25℃，誘導(dǎo)40～48 h，優(yōu)化后酶活達(dá)到81.2 U/mL，是未優(yōu)化前的1.9倍。本研究結(jié)果為目前國內(nèi)報道大腸桿菌搖瓶發(fā)酵產(chǎn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的最高酶活，為該酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；重組大腸桿菌；發(fā)酵優(yōu)化

L-茶氨酸（L-theanine）是綠茶中存在的一種天然氨基酸，也是茶葉的主要風(fēng)味物質(zhì)和活性成分[1]。研究表明，L-茶氨酸具有放松心情，提高注意力和學(xué)習(xí)能力，提高人體免疫力，防止腫瘤發(fā)生等保健功能，市場需求量逐漸增大[2]。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γglutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2）是生物法合成L-茶氨酸的關(guān)鍵酶，它具有轉(zhuǎn)移γ-谷氨酰基團(tuán)的活性，可以在L-谷氨酰胺和乙胺存在下，轉(zhuǎn)移L-谷氨酰胺中γ-谷氨酰基至乙胺，形成L-茶氨酸[3-4]。該方法具有操作簡便、反應(yīng)時間短等優(yōu)點，工業(yè)應(yīng)用前景良好，因此對其研究日益增多。此外，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶作為一種生物催化劑，還被廣泛應(yīng)用于合成其他谷氨酰類化合物[5]。

近年來，國內(nèi)已初步展開微生物發(fā)酵生產(chǎn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的研究，主要集中在Bacillus subtilis[6-9]和Escherichia coli[10-12]等菌株，但發(fā)酵活力較低，一般在3～6 U/mL。

作者所在實驗室前期對來源于B.subtilis 168的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在大腸桿菌中進(jìn)行了克隆表達(dá)。為進(jìn)一步實現(xiàn)GGT的高效胞外分泌，作者優(yōu)化了基因工程菌E.coli BL21（DE3）/pET-20b（+）/ggt的發(fā)酵產(chǎn)酶條件，為工業(yè)化生產(chǎn)高活力的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

作者所在實驗室構(gòu)建并保藏的基因工程菌E.coli BL21（DE3）/pET-20b（+）/ggt，含來源于Bacillus subtilis 168的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 LB培養(yǎng)基（g/L） 蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

1.2.2 TB培養(yǎng)基（g/L） 蛋白胨 12，酵母粉 24，甘油 5，磷酸氫二鉀 2.34，磷酸二氫鉀 16.43，甘氨酸7.5。

1.3 試劑

酵母粉、蛋白胨：購于Oxoid公司；異丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（Amp）：購自上海生工生物工程公司；其他試劑：均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 種子培養(yǎng) 取100 μL保藏于-80℃甘油管中，菌液接入含100 μg/mL Amp的種子培養(yǎng)基中（50 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶），于37℃、200 r/min培養(yǎng)8 h。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)8 h的種子以5%的接種體積分?jǐn)?shù)接入含100 μg/mL Amp的發(fā)酵培養(yǎng)基（50 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶），在25℃、200 r/min培養(yǎng)2 h后加入0.4 mmol/L的IPTG培養(yǎng)48 h。

1.5 分析方法

1.5.1 酶活力的測定 以γ-谷氨酰對硝基苯胺（L-γ-Glutamyl-p-nitroanilide）和雙甘二肽 （Gly-Gly）為底物進(jìn)行顏色反應(yīng)[13]。酶活測定體系為1 mL，含終濃度為5 mmol/L γ-谷氨酰對硝基苯胺，80 mmol/L雙甘二肽，50 mmol/L硼砂-NaOH緩沖液，pH 10，在37℃下加入20 μL適當(dāng)稀釋的酶液反應(yīng)5 min后，加入4 mol/L醋酸溶液400 μL終止反應(yīng)，在分光光度計410 nm處測定吸光值。該條件下每分鐘生成1 μmol對硝基苯胺（p-nitroaniline）所需的酶量定義為一個酶活單位（U）。

對硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制0.25 mmol/L對硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)樣品，用50 mmol/L硼砂-NaOH（pH 10）緩沖液稀釋成濃度為0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 mmol/L的溶液，用分光光度計于410 nm測定吸光值λ。以不同對硝基苯胺的濃度值為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制對硝基苯胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.5.2 細(xì)胞干重的測定 取1 mL菌液，12 000 r/min離心10 min，將沉淀（細(xì)胞）用0.9 g/dL氯化鈉溶液漂洗兩次，離心后于105℃烘箱內(nèi)烘干至恒重。DCW（g/L）=烘干后恒重（g）/0.001（L）

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌生長及產(chǎn)酶曲線

發(fā)酵過程中，種齡可影響發(fā)酵周期和產(chǎn)物合成量[14]。為縮短發(fā)酵周期和提高產(chǎn)物合成量，一般選擇在對數(shù)生長中后期的菌體作為種子，該階段具有菌體量大，生長速率快及活力強(qiáng)等特點。作者對LB培養(yǎng)基中菌體生長曲線進(jìn)行了研究。由圖1可知，菌體在0～4 h處于生長延滯期，在4～10 h處于對數(shù)生長期，在10 h以后處于生長穩(wěn)定期。其中，對數(shù)生長中后期在6～9 h，因此，選擇此時的菌體作為種子接入TB培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見圖2。菌體遲滯期較短，生長和產(chǎn)酶情況良好，其中產(chǎn)物在20～40 h處于快速合成期，在40 h左右達(dá)到最大胞外酶活，且酶活力穩(wěn)定，此時胞外酶活為42.6 U/mL。

圖1 重組菌在LB培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 Growth curve of E.coli in LB medium

圖2 重組菌在TB培養(yǎng)基中的生長和GGT合成曲線Fig.2 Cell growth and GGT production by E.coli in TB medium

2.2 重組菌發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵溫度的影響 發(fā)酵溫度對菌體生長和產(chǎn)物合成均有重要影響，因此確定合適的發(fā)酵溫度非常重要。作者研究了重組菌在發(fā)酵溫度分別為25、30、37℃時菌體生長和產(chǎn)酶的情況，結(jié)果見表1。在25℃時，菌體的生長和胞外酶活均最高，在30℃時菌體濃度較低，酶活僅為25℃時的一半，采用37℃時雖然菌體生長良好，但胞外酶活最低。因此選擇25℃作為發(fā)酵溫度繼續(xù)下一步優(yōu)化。

表1 發(fā)酵溫度對重組大腸桿菌生長和GGT合成的影響Table 1 Effect of fermentation temperature on the E.coli growth and GGT production

2.2.2 IPTG誘導(dǎo)濃度的影響 作者采用的pET-20b（+）表達(dá)載體，使用T7強(qiáng)啟動子控制目的基因的轉(zhuǎn)錄，可由乳糖或乳糖類似物IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶。IPTG具有誘導(dǎo)強(qiáng)度高、不被微生物代謝和降解的特點，因而被廣泛應(yīng)用。作者研究了IPTG的誘導(dǎo)濃度對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖3。在沒有加入IPTG誘導(dǎo)的情況下，菌體仍然可以產(chǎn)酶，但酶活較低；當(dāng)IPTG濃度在0～0.2 mmol/L時，酶活和菌體濃度隨IPTG濃度的增大而升高，在0.2 mmol/L時達(dá)到最高；當(dāng)IPTG濃度大于0.2 mmol/L時，其濃度對酶活和菌體生長影響較小，因此最終選取0.2 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。

圖3 IPTG誘導(dǎo)濃度對重組大腸桿菌生長和產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of the concentration of IPTG on the E.coli growth and GGT production

2.2.3 IPTG誘導(dǎo)時間的影響 IPTG誘導(dǎo)時間對菌體生長和產(chǎn)酶影響較大，在合適的時間誘導(dǎo)，可有效提高發(fā)酵產(chǎn)酶水平。如圖4所示，在37℃培養(yǎng)4 h后，添加0.02 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，并轉(zhuǎn)入25℃發(fā)酵，所得酶活最高，為52.3 U/mL，而誘導(dǎo)時間過晚也不利于產(chǎn)酶。

圖4 IPTG誘導(dǎo)時間對重組大腸桿菌生長和產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of the time of adding IPTG on the E.coli growth and GGT production

2.3 重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)基的成分需既能滿足微生物的生長繁殖，防止菌體過早衰老，又要有利于產(chǎn)物的合成。因此培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分包括碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長因子等，有時還可添加前體、抑制劑和促進(jìn)劑等物質(zhì)。作者在優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，研究了碳源、氮源、磷酸鹽和金屬離子對菌體生長和發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，以期提高產(chǎn)酶水平或減少抑制因素。

2.3.1 碳源種類及濃度對重組菌生長及產(chǎn)酶的影響 碳源是微生物生長的一類重要的營養(yǎng)物質(zhì)，常用的碳源有糖類、有機(jī)酸、油脂及小分子醇等。碳源物質(zhì)在微生物代謝中除了提供合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)所需的碳元素，更為細(xì)胞生命活動和產(chǎn)物合成提供能量，直接影響微生物生長和產(chǎn)酶過程[14]。作者以碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)相等的不同單一碳源替代TB培養(yǎng)基中5 g/L的甘油進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見圖5。甘油為最優(yōu)碳源，菌體濃度和胞外酶活均最高。接著，為確定最佳碳源濃度，作者考察了不同甘油質(zhì)量濃度下的菌體生長和產(chǎn)酶情況，見圖6。當(dāng)甘油質(zhì)量濃度為3～12 g/L時，提高甘油質(zhì)量濃度能明顯促進(jìn)菌體生長，而酶活呈現(xiàn)先增后降的趨勢，其中，甘油質(zhì)量濃度為8 g/L時，酶活最高，達(dá)到58.9 U/mL，因此選擇8 g/L的甘油作為碳源。

圖5 不同碳源對重組菌生長及產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on the E.coli growth and GGT production

2.3.2 氮源種類及濃度對重組菌生長及產(chǎn)酶的影響 氮源是構(gòu)成細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)的重要元素，包含NH3、N2和硝酸鹽等無機(jī)氮源和牛肉膏、蛋白胨、尿素、豆餅粉等有機(jī)氮源，對細(xì)胞生長和產(chǎn)酶影響重大。作者以氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)相等的不同單一氮源替代TB培養(yǎng)基中的酵母粉和蛋白胨進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見圖7。當(dāng)使用無機(jī)氮源或簡單的有機(jī)氮源時，產(chǎn)酶水平和菌體濃度均很低，無法滿足菌體生長和產(chǎn)酶的營養(yǎng)需要，而使用蛋白胨和酵母膏兩種營養(yǎng)豐富的有機(jī)氮源時效果較佳，但低于兩者復(fù)配使用時的發(fā)酵產(chǎn)酶水平，因此決定仍然使用復(fù)合氮源。為進(jìn)一步確定兩者復(fù)配使用的最佳比例，選取酵母粉和蛋白胨比例在4∶1至1∶4的區(qū)間進(jìn)行研究，結(jié)果見圖8。酵母粉比例上升，菌體濃度呈總體上升趨勢，當(dāng)酵母粉：蛋白胨為3∶1時，酶活最高，達(dá)到67.3 U/mL。隨后，進(jìn)一步確定了復(fù)合氮源的最佳濃度，見圖9。復(fù)合氮源濃度越高，菌體生長越好，但當(dāng)?shù)促|(zhì)量濃度高于36 g/L時，不利于菌體產(chǎn)酶，當(dāng)復(fù)合氮源質(zhì)量濃度為24 g/L時，雖然菌體濃度較低，但胞外酶活進(jìn)一步提高到72.1 U/mL。

圖6 甘油質(zhì)量濃度對重組菌生長及產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of different concentrations of glycerol on the E.coli growth and GGT production

圖7 不同氮源對重組菌生長及產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on the E.coli growth and GGT production

圖8 氮源復(fù)配比對重組菌生長及產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of different ratio of yeast extract：peptone on the E.coli growth and GGT production

圖9 復(fù)合氮源質(zhì)量濃度對重組菌生長及產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of different concentrations of nitrogen source on the E.coli growth and GGT production

2.3.3 磷酸鹽濃度對重組菌生長及產(chǎn)酶的影響磷元素是構(gòu)成細(xì)胞中核酸物質(zhì)、三磷酸腺苷和某些脂類物質(zhì)的重要元素，在細(xì)胞繁殖和能量代謝中起重要作用，因此磷是所有微生物生長所必需的，能明顯促進(jìn)微生物生長，但有時磷過量會抑制產(chǎn)物合成。同時，發(fā)酵培養(yǎng)基中的復(fù)合磷酸鹽還起到調(diào)節(jié)和穩(wěn)定培養(yǎng)基pH的作用。作者對TB培養(yǎng)基中的磷酸鹽濃度進(jìn)行研究，維持復(fù)合磷酸鹽比例不變，改變磷酸鹽總濃度，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見圖10。磷酸鹽濃度對菌體濃度影響不大，但對產(chǎn)酶影響很大，當(dāng)磷酸鹽濃度為120 mmol/L時，酶活最高，達(dá)到78.9 U/mL。 2.3.4 金屬離子對重組菌生長及產(chǎn)酶的影響 對于某些酶，金屬離子可作為這類酶的輔基，對保持酶的活性構(gòu)象起穩(wěn)定作用。金屬離子的添加也可能提高或降低酶活水平，因此發(fā)酵過程中常需考慮金屬離子的影響。作者為考察常見金屬離子對重組菌生長及產(chǎn)酶的影響，在培養(yǎng)基中添加了2.5 mmol/L的不同金屬離子，見圖11所示。添加金屬離子不能幫助提高酶活，其中添加Co2+，Cu2+和Al3+明顯抑制菌體生長，而多數(shù)金屬離子對酶活有不同程度的抑制作用。因此，發(fā)酵培養(yǎng)不用添加金屬離子同時應(yīng)在發(fā)酵過程中盡量避免金屬離子的摻入。

圖10 磷酸鹽濃度對重組菌生長及產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of different concentrations of phosphate on the E.coli growth and GGT production

圖11 金屬離子對重組菌生長及產(chǎn)酶的影響Fig.11 Effect of different metallic ions on the E.coli growth and GGT production

2.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的正交實驗 為考慮主要營養(yǎng)物質(zhì)對發(fā)酵產(chǎn)酶的綜合影響，選取對發(fā)酵酶活影響較大的碳源、氮源和磷酸鹽三個因素進(jìn)行三因素兩水平正交實驗，實驗設(shè)計方案見表2。

表2 正交實驗設(shè)計方案Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

對正交實驗結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表3。由極值大小C＞B＞A，即對酶活影響的作用大小排序為：磷酸鹽濃度＞甘油＞復(fù)合氮源，因此較優(yōu)的實驗方案為A2B2C2，即甘油10 g/L，氮源28 g/L，磷酸鹽130 mmol/L。采用此組合的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，最終酶活達(dá)81.2 U/mL。

表3 正交試驗極差分析結(jié)果Table 3 Analysis of results of orthogonal experiments

3 結(jié)語

作者以E.coli BL21（DE3）為表達(dá)宿主，異源表達(dá)來源于B.subtilis 168的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因。首先對發(fā)酵溫度、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時間等發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，較大幅度地提高了γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的表達(dá)量。隨后，對發(fā)酵培養(yǎng)基組分碳源、氮源、磷酸鹽及濃度進(jìn)行優(yōu)化研究，通過正交實驗最終確定了培養(yǎng)基最優(yōu)組成為：10 g/L甘油，21 g/L酵母粉，7 g/L蛋白胨，130 mmol/L磷酸鹽，優(yōu)化后酶活從42.6 U/mL提高到81.2 U/mL，較未優(yōu)化前提高了1.9倍，為目前所報道的大腸桿菌搖瓶水平產(chǎn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的最高酶活，為工業(yè)化生產(chǎn)該酶奠定了一定的基礎(chǔ)。

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Fermentation Optimization of Recombinant γ-Glutamyltranspeptidase from Bacillus subtilis 168 in E.coli

CHEN Xingyi1，2， SU Lingqia1，2， WU Jing*1，2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In the present study，in order to improve the production of the recombinant Bacillus subtilis γ-glutamyltranspeptidase in E.coli BL21（DE3）/pET-20b（+）/ggt，the culture conditions and medium compositions were investigated and optimized in shake flasks.The optimal fermentation medium was as follows：10 g/L glycerol，21 g/L yeast extract，7 g/L peptone，and 130 mmol/L PO43+. In addition，the optimal culture conditions were firstly cultured at 37℃，200 r/min for 4 h，and then induced by 0.2 mmol/L IPTG at temperature 25℃and 40～48 h.Under these conditions，the maximal enzyme activity reached 81.2 U/mL，which was 1.9 times as high as that not optimized.

Bacillus subtilis，γ-glutamyltranspeptidase，recombinant E.coli，fermentation optimization

Q 815

A

1673—1689（2015）08—0799—07

2014-02-25

國家自然科學(xué)基金項目（31100048）。

*通信作者：吳 敬（1969—），女，江蘇鎮(zhèn)江人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。E-mail：jingwu@jiangnan.edu.cn