梁 艷， 宋家鴻， 陳荊曉， 陳敬華

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

肝素/殼聚糖微膠囊的制備及其抗凝血性能

梁 艷， 宋家鴻， 陳荊曉， 陳敬華*

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

采用層層自組裝（LbL）技術(shù)制備了肝素/殼聚糖（HEP/CHI）5微膠囊，并研究了其抗凝血性能、胃腸道穩(wěn)定性和毒副作用等。結(jié)果表明：該微膠囊具有球形結(jié)構(gòu)；在pH 5.0、7.4中肝素能夠緩慢可控地釋放；在pH 5.0、7.4以及模擬胃液、腸液條件下具有穩(wěn)定性；APTT法和全凝固實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了它在體外具有良好的抗凝血效果；并且對內(nèi)皮細(xì)胞無細(xì)胞毒性。因此，該微膠囊有望作為口服劑型，用于臨床肝素給藥。

微膠囊；肝素；抗凝血；層層自組裝；口服劑型

肝素（Heparin，HEP）是一種臨床上廣泛使用的抗凝血藥物，一般采用靜脈或皮下注射方式給藥[1-2]。這一給藥方式對于有血凝塊危險(xiǎn)的病人而言，具有可能引發(fā)感染、病患適應(yīng)度低和成本高昂等問題[1]?？诜嗡厥墙暄芯康臒狳c(diǎn)，但肝素在胃腸道中存在易被降解失活[3-4]，難以透過黏膜吸收[5]等問題。層層自組裝（LbL）微膠囊是一種新型的多功能載體，其具有改善藥物穩(wěn)定性、控制藥物釋放以及可功能化修飾等優(yōu)點(diǎn)[6-7]。利用具有不同理化性質(zhì)的生物活性材料制備微膠囊，可有效改善藥物的穩(wěn)定性[6]和生物利用度[8]。殼聚糖（Chitosan，CHI）是一種天然的陽離子聚合物，具有良好的生物相容性、低毒性、生物可降解性、強(qiáng)生物粘附能力以及促進(jìn)藥物跨上皮黏膜傳遞等優(yōu)點(diǎn)[8-10]。將它作為載體，可以促進(jìn)藥物在胃腸道的滲透吸收[9，11]。本文作者通過LbL法制備（HEP/CHI）5微膠囊，并對其抗凝血性能、胃腸道穩(wěn)定性和毒副作用等性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

肝素鈉（分子量15 kDa），購于生物工程（上海）有限公司；殼聚糖鹽酸鹽（分子量50 kDa，脫乙酰度91%），購自浙江澳興生物科技有限公司；活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）測定試劑盒（鞣花酸），購自上海太陽生物技術(shù)有限公司；人血漿，由無錫市第四人民醫(yī)院提供；兔血，取自成年新西蘭兔。

S-4800型掃描電子顯微鏡 （SEM），H-7650型透射電子顯微鏡（TEM），日本日立有限公司制造；C1-si激光共聚焦電子顯微鏡（CLSM），日本尼康映像儀器有限公司制造；Zetasizer Nano ZS納米粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司制造；DMIL LED倒置熒光顯微鏡，德國徠卡儀器有限公司制造；Fluoroskan Ascent FL熒光和化學(xué)發(fā)光檢測儀，Multiskan GO通用微型孔板分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技有限公司制造。

1.2 （HEP/CHI）5微膠囊的制備

將CHI 1 mg溶于0.33 mol/L K2CO3溶液5 mL中，將等量CaCl2快速加入其中，制備CaCO3球形模板（Template）[12]。利用層層自組裝（LbL）技術(shù)[13]制備（HEP/CHI）5-Template微膠囊。將CaCO3微球150 mg浸沒到2 g/L肝素溶液1 mL中，37℃孵育15 min至靜電吸附達(dá)到平衡，用去離子水小心洗凈微球，之后再浸沒到2 g/L殼聚糖溶液1 mL中，繼續(xù)37℃下孵育15 min。重復(fù)上述操作，至（HEP/CHI）5微膠囊制備完成。加入0.4 mol/mL pH 7.4乙二胺四乙酸二鈉 （EDTA）溶液4 mL，除去CaCO3模塊，得到（HEP/CHI）5微膠囊。為進(jìn)行熒光觀測，用異硫氰酸熒光素（FITC）對HEP進(jìn)行標(biāo)記。

1.3 LbL自組裝條件優(yōu)化

首先對微球加入聚電解質(zhì)溶液中的吸附時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。操作步驟如1.2中所述，孵育時(shí)間為15 min或2 h。每吸附一次聚電解質(zhì)，取樣用去離子水洗凈后再分散于水中，此時(shí)微球渾濁液pH為9.4，測定微球表面的ζ-電勢。隨后對LbL自組裝過程中聚電解質(zhì)的濃度進(jìn)行優(yōu)化。將CaCO3微球150 mg，分別加入不同濃度的等體積肝素或者殼聚糖溶液中，37℃孵育15 min，收集沉淀，再分散到pH 7.4或pH 9.4的緩沖液中，分別測量微球表面的ζ-電勢。檢測殼聚糖濃度影響時(shí)，CaCO3微球?qū)⑾任揭粚痈嗡睾?，再吸附不同濃度的殼聚糖。誤差棒由3組平行樣品計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差所得。

1.4 LbL自組裝過程中微球表面ζ-電勢和粒徑的變化趨勢

將CaCO3微球150 mg使用層層自組裝技術(shù)（LbL）裝配微膠囊壁，操作過程如1.2所述。將微球再分散到pH 7.4緩沖液后，使用Nano ZS納米粒度儀測量ζ-電勢和粒徑。誤差棒由3組平行樣品計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差所得。

1.5 CaCO3微球與（HEP/CHI）5微膠囊形貌觀察

將少量CaCO3微球滴至鋁箔片上，干燥后噴金處理，用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察CaCO3微球的形貌。將（HEP/CHI）5微膠囊用0.2 g/mL磷鎢酸鈉溶液染色，使用透射電子顯微鏡（TEM）觀察其干態(tài)下形貌。將（HEP/CHI）5微膠囊用激光共聚焦電子顯微鏡 （CLSM）觀察其在水溶液中的形貌，微膠囊中HEP用FITC標(biāo)記。

1.6 抗凝血活性分析

將0.1、0.5、2 g/L（HEP/CHI）5微膠囊、0.25 g/L肝素、生理鹽水各1 mL，分別加入兔血2 mL中，于0 h和1 h后拍攝照片。肝素作為陽性對照，生理鹽水作為陰性對照。

利用APTT法檢測 （HEP/CHI）5微膠囊的抗凝血時(shí)間。將0.445 g/L（HEP/CHI）5微膠囊于37℃中孵育，待HEP釋放1 h或24 h后，分別取樣品15 μL和人血漿100 μL混合，按照活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）測定試劑盒說明書操作，記錄凝血時(shí)間。生理鹽水作為對照組。

隨后檢測微膠囊質(zhì)量濃度對凝血時(shí)間的影響。將梯度質(zhì)量濃度（HEP/CHI）5微膠囊置于37℃中孵育，待HEP釋放24 h后，APTT法檢測溶液的抗凝血時(shí)間，肝素作為對照組。

1.7細(xì)胞毒性試驗(yàn)

將內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基加入了質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清FBS和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%雙抗（青霉素與鏈霉素，10 000 U/mL），37℃，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%CO2濕潤環(huán)境培養(yǎng)。MTT法測試（HEP/CHI）5微膠囊對ECs的細(xì)胞毒性。將細(xì)胞用胰酶消化后加入96孔細(xì)胞板中，每孔8 000個(gè)細(xì)胞。每孔加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基。再加入梯度質(zhì)量濃度的（HEP/CHI）5微膠囊100 μL，培養(yǎng)24 h后，PBS沖洗，每孔加入MTT（0.5 mg/mL，PBS）110 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去孔中液體，加入二甲亞砜100 μL，充分溶解生成的甲瓚，使用通用微型孔板分光光度計(jì)測量570 nm處的UV吸收OD值，通過公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。肝素作為對照組。

式（1）中：ODyp為加入藥物時(shí)的UV吸收值，ODdz為不加藥物時(shí)的UV吸收值，RC為細(xì)胞存活率。

1.8 穩(wěn)定性分析

利用肝素的釋放行為檢測 （HEP/CHI）5微膠囊在pH 5.0或7.4條件下的穩(wěn)定性。將（HEP/CHI）5微膠囊約75 mg分散于1 mL水中，兩等分，分別加入透析袋（MWCO 25 kDa）中，之后將透析袋置于pH 5.0或7.4 PBS溶液6 mL中進(jìn)行透析。間隔一定時(shí)間取樣，樣品在激發(fā)波長480 nm、發(fā)射波長520 nm處測定FITC的熒光強(qiáng)度，并由公式（2）計(jì)算HEP的累積釋放率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

式（2）中：Mt為t時(shí)刻HEP的累積釋放量，Mo為微膠囊中HEP總量，RS為HEP累計(jì)釋放率。

為了測量 （HEP/CHI）5微膠囊中HEP的總量，將微膠囊12.5 mg加入6 mol/L HCl溶液1 mL中，測量FITC熒光強(qiáng)度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算HEP總量，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為520 nm。

隨后檢測（HEP/CHI）5微膠囊在模擬胃液、腸液條件下的穩(wěn)定性。將（HEP/CHI）5微膠囊25 mg分別加入到模擬胃液1 mL（胃蛋白酶活力>1 200 U/mL，pH 2）或模擬腸液1 mL（胰酶，pH 6.8）中，于37℃孵育，間隔一定時(shí)間取樣，樣品置于沸水中3 min使酶失活后，使用倒置熒光顯微鏡拍攝圖像。PBS作為對照組。

2 結(jié)果與討論

2.1 LbL自組裝條件優(yōu)化

2.1.1 聚電解質(zhì)沉積時(shí)間選擇在LbL自組裝過程中，微球吸附聚電解質(zhì)的時(shí)間長短，可能影響聚電解質(zhì)吸附到微球表面的量。如圖1（a）所示，不同的吸附時(shí)間15 min和2 h導(dǎo)致的ζ-電勢變化差異并不明顯，這說明15 min的時(shí)間長度已經(jīng)足夠聚電解質(zhì)在微球表面吸附達(dá)到平衡狀態(tài)，延長時(shí)間并不能使更多的聚電解質(zhì)沉積到微球表面。相反，2 h反而會使實(shí)驗(yàn)誤差增大，穩(wěn)定性下降。因此15 min更適合作為聚電解質(zhì)的沉積時(shí)間。

2.1.2 聚電解質(zhì)濃度對微膠囊制備的影響已有研究文獻(xiàn)[14]報(bào)道，聚電解質(zhì)濃度的強(qiáng)弱也是影響LbL自組裝的因素之一，因此對其進(jìn)行優(yōu)化。從圖1（b）可知，隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的增大，微球表面ζ-電勢呈現(xiàn)明顯上升趨勢，質(zhì)量濃度低于0.5 g/L時(shí)上升趨勢迅猛，2 g/L后才逐漸平穩(wěn)。這一方面表明低質(zhì)量濃度殼聚糖不足以使微球表面靜電吸附達(dá)到平衡。另一方面質(zhì)量濃度過大（>3 g/L）時(shí)，殼聚糖溶液黏度將大幅上升，降低它的分子擴(kuò)散速度，影響自組裝效率。因此，2 g/L殼聚糖最為適合。另外，由圖1（c）可知，隨著肝素質(zhì)量濃度的增大微球表面ζ-電勢呈現(xiàn)明顯下降趨勢，低質(zhì)量濃度時(shí)ζ-電勢迅速下降，2 g/L后ζ-電勢幾乎不再變化。但隨著肝素質(zhì)量濃度繼續(xù)升高，誤差有所增大。所以選取2 g/L肝素為宜。

另外，在圖1（a）中所有ζ-電勢值均處于負(fù)值，這并不符合微膠囊LbL組裝的原理。這種現(xiàn)象可能是由于測量時(shí)微球懸液的pH值所致。因此隨后檢測了pH 9.4（CaCO3微球渾濁液pH）和pH 7.4（血液pH）條件對ζ-電勢的影響。如圖1（b）（c）所示，pH 7.4時(shí)ζ-電勢數(shù)值范圍與pH 9.4時(shí)幾乎均相差20 mV左右，但隨質(zhì)量濃度變化的趨勢基本相同。這表明圖1（a）中ζ-電勢均為負(fù)值的現(xiàn)象主要是由于檢測時(shí)pH為9.4所導(dǎo)致，而非為微膠囊制備工藝本身的原因。將檢測時(shí)pH調(diào)節(jié)為7.4后，如圖1（d）所示，ζ-電勢將隨聚電解質(zhì)膜層數(shù)的增加，呈現(xiàn)明顯的正負(fù)值交替現(xiàn)象。這表明帶有相反電荷的肝素和殼聚糖交替吸附到CaCO3模板的表面，完成了LbL自組裝的過程。

圖1 LbL自組裝過程Fig.1 During LbL self-assembly （a） impactof polyelectrolyte coating time， impact of（b）heparin or（c）chitosan ionic strength，（d）ζ-potential and size of each layers

2.2 CaCO3微球與（HEP/CHI）5微膠囊形貌觀察

隨后對微膠囊形貌特征和粒徑變化進(jìn)行了觀察。從形貌上看，SEM圖2（a）中CaCO3內(nèi)核具有適于微膠囊制備的球霰石晶體微球形態(tài)[15-16]，結(jié)構(gòu)致密。TEM圖2（b）顯示（HEP/CHI）5微膠囊為多孔松散的膜結(jié)構(gòu)，表明這種微膠囊可能具有較強(qiáng)滲透性。CLSM圖2（c）中還可觀察到這種藥物載體是內(nèi)有空腔的圓形膠囊結(jié)構(gòu)。

從粒徑變化來說，圖1（d）顯示在LbL自組裝過程中微球的尺寸基本都保持在4 μm左右，沒有隨膠囊壁的組裝而大幅增加。由CaCO3球SEM圖2（a）可知，CaCO3微球模板尺寸大約在3.9 μm左右，兩者差別較小，可推斷微膠囊尺寸大小主要由模板的尺寸決定。另外TEM圖2（b）中微膠囊的粒徑大約在4.2 μm，CLSM圖2（c）中粒徑卻大約為5.2 μm。這種尺寸變化可能是由于CaCO3模板去除后微膠囊內(nèi)腔中無機(jī)離子濃度增加使?jié)B透壓增加，從而使微膠囊發(fā)生膨脹的緣故，表現(xiàn)在CLSM圖2（c）中微膠囊尺寸偏大。拍攝TEM圖像時(shí)微膠囊脫水又導(dǎo)致它收縮并塌陷，微膠囊尺寸縮小。

圖2 FITC熒光標(biāo)記微膠囊中HEPFig.2 （a）SEM observation of CaCO3template，（b）TEM and（c）CLSM images of（HEP/CHI）5microcapsule labelled by FITC

2.3微膠囊的抗凝血活性和毒副作用

如圖3（a）（b）所示，0 h時(shí)所有試管中血液均為未凝固狀態(tài)，但1 h后生理鹽水和0.1、0.5 g/L微膠囊試管中血液已經(jīng)凝固，肝素和2 g/L微膠囊試管中血液沒有凝固，這說明（HEP/CHI）5微膠囊具有抗凝血功效，能夠延長凝血時(shí)間。

為了進(jìn)一步研究 （HEP/CHI）5微膠囊的抗凝血效果，使用APTT法測試了不同釋放時(shí)間后微膠囊懸液的抗凝血時(shí)間。對比于對照組生理鹽水（37±1）s的凝血時(shí)間，不同時(shí)間后的微膠囊懸液都能延長血漿的凝血時(shí)間，1 h后微膠囊懸液的抗凝血時(shí)間延長（11±3）s，而24 h后的抗凝血時(shí)間則為（90±6）s左右。這表明微膠囊的抗凝血功效依賴于肝素的釋放。此外，如圖3（c）所示，隨著微膠囊質(zhì)量濃度的增大，抗凝血時(shí)間也逐漸延長，并且微膠囊的質(zhì)量濃度與抗凝血效果呈正相關(guān)。

另外，由圖3（d）內(nèi)皮細(xì)胞ECs的MTT細(xì)胞毒性結(jié)果可知，（HEP/CHI）5微膠囊對ECs細(xì)胞幾乎沒有毒性，說明這種微膠囊毒副作用極小。

2.4 微膠囊穩(wěn)定性

為了研究 （HEP/CHI）5微膠囊在胃腸道中的穩(wěn)定性，利用肝素在pH 5.0和7.4條件下的體外釋放行為，檢測微膠囊在十二指腸（pH 4.2～8.2）和腸道（pH 7.4）環(huán)境的穩(wěn)定性。微膠囊中肝素載藥率為（37.5±0.3）%。如圖3（e）所示，兩種pH下肝素都以極緩慢的速率釋放，到24 h后HEP的釋放量還不足微膠囊中肝素總量的30%。這說明該微膠囊在pH 5.0和7.4條件下是穩(wěn)定的。

圖3 血液中加入微膠囊Fig.3 Blood coagulation state after（a）0 h and（b）1 h，（c）Impact of microcapsule concentration on anticoagulanteffect，（d）ECs cellcytotoxicity assay，（e）Heparin release behavior

此外，還進(jìn)一步檢驗(yàn)了（HEP/CHI）5微膠囊在模擬胃液或模擬腸液中的穩(wěn)定性，如圖4所示。在經(jīng)過4 h模擬胃液或模擬腸液處理后，微膠囊依然保持良好的圓環(huán)形狀，絕大部分微膠囊都未被降解。由此可以推斷，該微膠囊對胃腸道環(huán)境應(yīng)當(dāng)具有穩(wěn)定性，有望作為口服劑型用于肝素給藥。

3 結(jié)語

在口服藥物的研究中，藥物胃腸道的吸收通常有4個(gè)主要影響因素——藥物的溶解性、穩(wěn)定性、膜通透性和首過效應(yīng)[17]。一方面，藥物的溶解性和穩(wěn)定性可以通過藥物傳遞技術(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)；另一方面，表面活性劑等吸收促進(jìn)劑可以改善藥物的跨胃腸道黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)，提高藥物的生物利用度[17]。

圖4 （HEP/CHI）5微膠囊的FITC熒光標(biāo)記圖像（標(biāo)尺為10 μm）Fig.4 Fluorescence images of FITC labelled（HEP/CHI）5microcapsules incubating in（a）PBS，（b）simulated gastric fluid or（c）simulated intestinal fluid（The scale bar was 10 μm）

本文作者設(shè)計(jì)的微膠囊可以在胃腸道中為HEP隔離周遭不利環(huán)境，提高了HEP的穩(wěn)定性。另已有文獻(xiàn)報(bào)道，CHI是一種具有良好生物相容性的黏膜傳遞吸收促進(jìn)劑[10]，可以促使緊密連接的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（ZO-1、閉合蛋白質(zhì)）和細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)（F-肌動蛋白質(zhì)）等重新分布，改變上皮細(xì)胞的緊密連接和細(xì)胞骨架，使藥物能夠跨上皮黏膜傳遞[8]。CHI的促進(jìn)作用有可能增強(qiáng)HEP在胃腸道中的滲透吸收。此外，在微膠囊的LbL制備工藝中，常規(guī)載藥方式制得的微膠囊往往在最初幾個(gè)小時(shí)將大部分HEP釋放。但在人機(jī)體內(nèi)低質(zhì)量濃度HEP就已經(jīng)具備預(yù)防血栓形成的功效[18]。Frank Caruso等人[19]提出的膜間載藥新方式，將更適合微膠囊中HEP緩慢釋放的需求。

根據(jù)上述思路制備的（HEP/CHI）5微膠囊，不僅有可能促進(jìn)肝素的胃腸道吸收，有效地減緩HEP釋放速率，并延長它在血液中的循環(huán)時(shí)間，還具有促進(jìn)HEP口服吸收的潛力，有望作為口服劑型用于肝素給藥，具有很大的市場前景。

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Preparation of Heparin/Chitosan Microcapsule for Anticoagulation Study

LIANG Yan， SONG Jiahong， CHEN Jingxiao， CHEN Jinghua*
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Heparin/chitosan（HEP/CHI）5microcapsules for anticoagulation were prepared by Layerby-layer（LbL）technique.The stability of（HEP/CHI）5microcapsules under pH 5.0 and 7.4，simulated gastric and intestinal juices conditions was studied respectively，APTT anticoagulant time and cytotoxicity of microcapsules against endothelial cells were estimated.Results indicated that（HEP/CHI）5microcapsuleswere ofsphericalstructure and stable in differentsimulated physiological milieus；they could behave favorable anticoagulant efficacy with no significant cytotoxicity.Thus，（HEP/CHI）5microcapsules were promising for clinical heparin administration as a novel oral dosage form.

microcapsule，heparin，anticoagulation，LBL，oral dosage form

R 944.9

A

1673—1689（2015）03—0295—07

2014-04-11

教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目（20110093110008）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2012557）。

*通信作者：陳敬華（1971—），男，湖北黃石人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事生物大分子和生物功能材料的研究。

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