康秋紅，李俊曉，譚文

HPLC法檢測異甜菊醇鈉注射劑中的有關(guān)物質(zhì)

康秋紅，李俊曉，譚文

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/生物醫(yī)藥前孵化器研究中心/廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室，廣東廣州510006)

目的建立高效液相色譜法檢查異甜菊醇鈉注射劑(STVNa注射劑)中的有關(guān)物質(zhì)。方法采用C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以水和乙腈為流動相進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，柱溫為40℃，檢測波長為210 nm。結(jié)果空白溶劑及空白輔料均不干擾檢測，本方法可將異甜菊醇(ISV)粗品和STVNa注射劑經(jīng)破壞性試驗所得樣品中的雜質(zhì)進(jìn)行有效分離；重復(fù)性考察的RSD值為13%；在0.003 ～1 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 6。結(jié)論本方法專屬性強、重復(fù)性好，可用于STVNa注射劑中有關(guān)物質(zhì)的檢查。

異甜菊醇；有關(guān)物質(zhì)；HPLC法

從甜菊葉中提取分離得到的甜菊糖苷是一種低卡路里的甜味劑，其甜度大約是0.4%(質(zhì)量濃度)蔗糖溶液的300倍，屬于二萜類化合物大家族。甜菊糖苷具有抗高血壓、抗感染、抗腫瘤和免疫活性等多種藥理活性[1]，在其原產(chǎn)地南美巴拉圭、巴西等地，已有幾百年的食用歷史，至今沒有關(guān)于其不良反應(yīng)的報道。

異甜菊醇(isosteviol，ISV)是從甜菊糖苷中提取分離得到的化學(xué)單體，異甜菊醇鈉(isosteviol sodium，STVNa)是ISV的鈉鹽形式。異甜菊醇及其鈉鹽對于心肌缺血再灌注損傷具有較好的保護作用[2-4]，是較為理想的治療心腦血管疾病的藥物，與同類藥物相比，在發(fā)揮藥理效應(yīng)的同時不影響心率和血壓，在增強心功能的同時不增加耗氧量，填補了缺血保護藥的空白。因此STVNa是一個極具開發(fā)前景的新藥，但關(guān)于其有關(guān)物質(zhì)的檢測分析方法文獻(xiàn)鮮有報道。本中心研究開發(fā)出一種適用于靜脈注射的STVNa注射劑，并對其有關(guān)物質(zhì)的檢測方法進(jìn)行開發(fā)及考察，以期為STVNa及含STVNa制劑的有關(guān)物質(zhì)檢測提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司，包括SPD-M20A檢測器、CBM-20A色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))；ML 104/02萬分之一分析天平(METTLER TOLEDO公司)；MILLI-Q 10A純水儀(THERMO SCIENTIFIC公司)。

STVNa原料藥(東莞凱法生物醫(yī)藥公司，批號: 140219-1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99.9%)，STVNa注射劑(珠海潤都制藥有限公司，批號:140224、140225、140226，規(guī)格:2.5 mg/mL)，ISV粗品(東莞凱法生物醫(yī)藥公司，批號:080715-1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97%)，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 主藥儲備液的制備 精密稱取STVNa原料藥適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的溶液，作為主藥儲備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取STVNa注射劑適量，加0.2%(體積分?jǐn)?shù))甲酸甲醇溶液稀釋制成每1 mL中含有2 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.1.3 陰性溶液的制備 按處方量量取除主藥外的輔料，按“2.1.2”項下方法制備成陰性溶液。

2.1.4 對照溶液 精密量取供試品溶液適量，加甲醇稀釋制成每1 mL中含0.02 mg的溶液，作為對照溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱為C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為水和乙腈，按表1程序進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，柱溫為40℃，檢測波長為210 nm。精密量取供試品溶液進(jìn)樣量為20 μL。理論塔板數(shù)按STVNa峰計大于8 000，拖尾因子1.05，空白溶劑及空白輔料不干擾有關(guān)物質(zhì)的測定。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution mobile phase

2.3 專屬性試驗

2.3.1 粗品中有關(guān)物質(zhì)的分離 取ISV粗品[5]適量，精密稱定，加甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度5 mg/mL的溶液，按“2.2”項下色譜條件檢測，檢出雜質(zhì)23個，分別標(biāo)記為雜質(zhì)1～18和雜質(zhì)20～24。ISV粗品中主峰與附近的雜質(zhì)峰、各雜質(zhì)峰之間能達(dá)到有效分離，見圖1。

圖1 ISV粗品檢測的HPLC圖Figure 1 HPLC Chromatogram of ISV

2.3.2 強酸破壞試驗 精密量取本品、陰性溶液和主藥儲備液各8 mL，分別置10 mL容量瓶中，加1 mol/L HCl 1 mL，2 h后加1 mol/L NaOH 1 mL，收集樣品，濾過，取續(xù)濾液20 μL，按“2.2”項下條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。見圖2A。

2.3.3 強堿破壞試驗 精密量取本品、陰性溶液和主藥儲備液各8 mL，分別置10 mL容量瓶中，加1 mol/L NaOH 1 mL，2 h后加1 mol/L HCl 1 mL，收集樣品，濾過，取續(xù)濾液20 μL，按“2.2”項下條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。見圖2B。

2.3.4 氧化破壞試驗 精密量取本品、陰性溶液和主藥儲備液各8 mL，分別置10 mL容量瓶中，加30%(體積分?jǐn)?shù))雙氧水1 mL，2 h后加0.2%甲酸甲醇溶液稀釋定容，濾過，取續(xù)濾液20 μL，按“2.2”項下條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。

2.3.5 高溫破壞試驗 精密量取本品、陰性溶液和主藥儲備液各8 mL，分別置10 mL容量瓶中，130℃下放置4 h后，加0.2%甲酸甲醇溶液稀釋定容，濾過，取續(xù)濾液20 μL，按“2.2”項下條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。

2.3.6 強光破壞試驗 精密量取本品、陰性溶液和主藥儲備液各8 mL，分別置10 mL容量瓶中，置強光(8 000 lx)下照射24 h，加0.2%甲酸甲醇溶液稀釋定容，濾過，取續(xù)濾液20 μL，按“2.2”項下條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。

2.3.7 破壞性試驗結(jié)果分析 根據(jù)破壞性試驗的色譜行為分析，樣品經(jīng)酸、堿破壞后新產(chǎn)生了8個較明顯的雜質(zhì)峰，分別標(biāo)記為雜質(zhì)10、11、12、15、23、25、27、28，其中強酸、強堿破壞均產(chǎn)生雜質(zhì)15、27，雜質(zhì)21和26存在于未破壞的樣品中，但經(jīng)酸堿破壞后其峰顯著增大。雜質(zhì)13來源于陰性溶液，雜質(zhì)11、12、15、23來源于ISV粗品，原料藥經(jīng)強堿破壞試驗后產(chǎn)生雜質(zhì)11，各組分峰與輔料峰的分離度均符合要求。樣品經(jīng)強光、高溫及強氧化破壞僅雜質(zhì)峰21、26顯著增大，其他未改變。破壞性試驗的代表性圖譜見圖2。

圖2 樣品、陰性、主藥降解前后的HPLC分離圖譜Figure 2 HPLC chromatograms of the sample，negative，the primary drug before and after degradation

2.4 線性關(guān)系的考察

精密稱量STVNa 50 mg至25 mL容量瓶中，加0.2%甲酸甲醇溶液稀釋制成2 mg/mL儲備液，搖勻，加甲醇分別稀釋制成質(zhì)量濃度為0.003、0.005、 0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL的溶液，分別按“2.2”項下條件測定，記錄色譜圖。以STVNa質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，STVNa峰面積(A)為縱坐標(biāo)作圖，計算線性回歸方程。結(jié)果表明STVNa在0.003 ～1 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積響應(yīng)值線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A＝1.0×106ρ＋2.289 5×103，r2為0.999 6。

2.5 檢測限和定量限的測定

精密稱量STVNa 50 mg至25 mL容量瓶中，加0.2%甲酸甲醇溶液稀釋制成2 mg/mL儲備液，搖勻，將儲備液用甲醇逐級稀釋，并將稀釋后的溶液分別進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。以信噪比10∶1時的質(zhì)量濃度為定量限，信噪比3∶1時的質(zhì)量濃度為檢測限。結(jié)果顯示STVNa的定量限為3 μg/mL，檢測限為1 μg/mL。

2.6 供試品溶液的穩(wěn)定性考察

分別精密吸取“2.1”項下的供試品溶液和對照溶液20 μL，按“2.2”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10 h測定，記錄峰面積并計算RSD值。結(jié)果待測定溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定，樣品可檢出雜質(zhì)21、26，10 h內(nèi)未出現(xiàn)其他雜質(zhì)，測定有關(guān)物質(zhì)平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.19%，RSD值為13%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 樣品的測定

分別取 3批 STVNa注射劑(批號:140224、140225、140226)，按“2.1”項下方法制備供試品溶液及對照溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算有關(guān)物質(zhì)。結(jié)果3批樣品均可檢出雜質(zhì)21和26，分別為 0.09%、0.09%；0.10%、0.11%；0.08%、0.11%，STVNa原料藥中無雜質(zhì)檢出，雜質(zhì)21和26 在STVNa注射劑中間體(過濾前樣品)中未檢出，推測可能來源于過濾工藝中。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

通過全波長掃描法確定210 nm作為STVNa注射劑中有關(guān)物質(zhì)的檢測波長，與其特征最大吸收波長291 nm相比，在210 nm處雜質(zhì)檢出能力強。譬如，在ISV粗品及強酸、強堿破壞性試驗樣品中，選擇210 nm作為檢測波長，雜質(zhì)檢出個數(shù)分別為23、9、7個，總雜質(zhì)檢出量分別為8.1%、14.7%、26%；而選擇291 nm作為檢測波長，雜質(zhì)檢出個數(shù)分別為8、2、1，總雜質(zhì)檢出量分別為2.3%、6.8%、9%。

3.2 流動相的選擇

ISV為天然產(chǎn)物提取物，粗品中含有的雜質(zhì)比較多(23個)，STVNa注射劑破壞試驗降解雜質(zhì)較少(8個)，所以采用ISV粗品優(yōu)化色譜條件。通過對流動相比例、柱溫、流速的調(diào)整[6-7]，根據(jù)雜質(zhì)洗脫數(shù)量及分離度等情況，經(jīng)篩選調(diào)整確定了本文的色譜條件。本條件可將ISV粗品中各成分有效分離，對破壞性試驗樣品中的雜質(zhì)分離度亦較好，結(jié)果令人滿意。

3.3 粗品中雜質(zhì)與破壞性試驗中雜質(zhì)的關(guān)系

本研究通過破壞性試驗，共分離出8個雜質(zhì)，分別為雜質(zhì)10、11、12、15、23、25、27、28，其中雜質(zhì)11、12、15、23來源于ISV粗品，雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)和降解機理有待進(jìn)一步研究[8]。在強酸、強堿破壞試驗中，均收集到2個樣品，因樣品加入強酸強堿后變渾濁，遂取渾濁樣品濾過得樣品1，取渾濁樣品加甲醇助溶后濾過得樣品2，圖2顯示的是樣品2的檢測色譜圖。樣品2較樣品1檢測出的雜質(zhì)數(shù)目多且量大，可能是因為強酸、強堿破壞產(chǎn)生的雜質(zhì)水溶性差，需加甲醇助溶后才被檢測到。

[1]CHATSUDTHIPONG V，MUANPRASAT C.Stevioside and related compounds:Therapeutic benefits beyond sweetness [J].Pharm Therapeut，2009，121(1):41-54.

[2]TAN W.The use of kauranes compounds in the manufacture of medicament:European，EP1757282A1[P].2007-02-28 [2015-05-21].

[3]HERMANSEN K，JEPPESEN PB.Elevation of the plasma HDL-cholesterol level:United States，US20110038827A1 [P].2011-02-17[2015-05-21].

[4]XU DY，DU WF，ZHAO L，et al.The neuroprotective effects of isosteviol against focal cerebral ischemia injury induced by middle cerebral artery occlusion in rats[J].Plant Medica，2008，74(8):816.

[5]《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組. GPH3-1化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則[EB/OL]. (2005-03-18)[2015-05-21].http://www.sfda.gov.cn/ WS01/CL0844/10368.html.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄29-31.

[7]許哲，周寧，許旭，等.使用大環(huán)糖肽抗生素鍵合固定相高效液相色譜法直接拆分卡巴拉汀[J].分析化學(xué)研究簡報，2007，35(7):1043-1047.

[8]張蜀，陳睿妍，鄧紅，等.愈酚偽麻待因口服溶液中有關(guān)物質(zhì)檢查方法的研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2009，25 (4):365-367.

(責(zé)任編輯:劉曉涵)

Determination of impurities in isosteviol sodium injection by HPLC

KANG Qiuhong，LI Junxiao，TAN Wen
(School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；Pre-incubator for Innovative Drugs and Medicine Center，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；Guangdong Provincial Key Laboratory of Fermentation and Enzyme Engineering，Guangzhou 510006，China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of impurities in isosteviol sodium (STVNa)injection.MethodsThe separation was performed on C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)column eluted with a linear gradient mobile phase of water and acetonitrile.The flow rate was 0.8 mL/min and column temperature was 40℃.The detection wavelength was set at 210 nm.ResultsBlank solvents and accessories caused no interference.The impurities were separated well in crude ISV samples and destructive testing of STVNa injection.RSD was 13%in the repeatability experiments.The calibration curve was linear within the range of 0.003-1 mg/mL，and the correlation coefficient was 0.999 6.ConclusionThis method is specific and reproducible for the determination of impurities in STVNa injection.

isosteviol；impurities detection；HPLC

R917

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.009

1006-8783(2015)05-0598-04

2015-05-21

東莞松山湖創(chuàng)新生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)集群建設(shè)項目(2012B011000050)

康秋紅(1989—)，女，2012級碩士研究生，從事醫(yī)藥生物學(xué)研究，Email:18620175384＠163.com；通信作者:譚文(1956—)，男，博士生導(dǎo)師，從事醫(yī)藥生物學(xué)研究，Email:went＠scut.edu.cn。

時間:2015-10-19 14:59

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20151019.1459.002.html