張成成，張立，張文軍，3

綜述

丙肝病毒基因組、免疫逃逸及其疫苗研究進展

張成成1，張立2，張文軍1，3

(1.廣東藥學院基礎(chǔ)學院，廣東廣州510006；2.中山大學中山眼科中心，廣東廣州510060；3.武漢大學病毒學國家重點實驗室，湖北武漢430072)

丙型肝炎標準療法(SoC)及一些新型抗病毒藥物的應用，存在治療效果欠佳，費用昂貴，副作用多等問題。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，丙肝病毒疫苗的研制取得了重大進展。雖然目前還沒有一種疫苗能夠直接應用于臨床，但是丙肝病毒疫苗在治療和預防丙肝方面仍有巨大的前景。本文將重點闡述HCV基因組結(jié)構(gòu)及特點、相關(guān)免疫逃逸機制以及一些頗具前景的候選疫苗。

丙肝病毒；基因組；免疫逃逸；疫苗

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是一種經(jīng)過血液傳播的肝炎病毒。目前，丙型肝炎呈全球性流行趨勢，是歐美、日本及中國等國家慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌的重要原因之一。據(jù)統(tǒng)計，全球約有3%的人口(約1.7億人)感染HCV，每年新增丙型肝炎病例300～400萬例[1-2]。我國血清流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，國內(nèi)一般人群抗HCV陽性率為3.2%?？笻CV陽性率隨年齡增長而逐漸上升。HCV1和2a型在我國最為常見，其中以1b型為主；部分地區(qū)有1a、2b和3b型相關(guān)報道；6型多要見于港、澳地區(qū)。雖然常規(guī)的抗病毒治療方案(標準療法SoC、新型抗病毒藥物DAAs)能取得一定的治療效果，但是其費用高，副作用大，而且不能從根本上解決丙肝的治療難題，因此，HCV疫苗的研制勢在必行。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，丙肝病毒疫苗的研制也取得了重大的進展。雖然目前還沒有一種疫苗能直接應用于臨床，但是丙肝病毒疫苗在治療和預防丙肝方面仍有巨大的前景。本文將重點闡述HCV基因組結(jié)構(gòu)，相關(guān)免疫逃逸機制以及一些頗具前景的候選疫苗。

1 HCV基因組的結(jié)構(gòu)及功能

HCV屬黃病毒科丙型肝炎病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，基因組全長9 600個堿基對(bp)，含有1個開放的編碼區(qū)(OFR)，可編碼一個多聚蛋白前體，該蛋白前體由宿主和病毒的信號肽酶剪接成3個結(jié)構(gòu)蛋白(核心蛋白、E1、E2)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)[3]。HCV核心蛋白為病毒核衣殼的重要組成部分，通過與病毒RNA的結(jié)合來調(diào)節(jié)HCV基因組的翻譯。包膜糖蛋白E1和E2分別構(gòu)成病毒的外膜，介導病毒進入宿主細胞。E2區(qū)N 端HVR1高度變異，導致HCV易于逃避宿主免疫應答[4]。

1.1 結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)

1.1.1 核心蛋白(HCV core protein，HCV C) HCV C

蛋白由191個氨基酸殘基組成，是HCV基組中較為保守的結(jié)構(gòu)區(qū)域，位于 HCV基因組342～914 nt區(qū)段。HCV C蛋白為病毒核衣殼的重要組成部分，與糖蛋白作用組裝出完整的HCV病毒顆粒。C蛋白通過與病毒RNA的結(jié)合來調(diào)節(jié)HCV基因組的翻譯。有研究表明HCV C蛋白可抑制腫瘤抑制基因p53啟動子的活性，與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[5]。

1.1.2 包膜糖蛋白(envelope glycoproteins) 包膜區(qū)基因包括E1和E2兩部分，分別位于基因組的第915～1 490 nt區(qū)段(E1)和1491～2579 nt區(qū)段(E2)，分別編碼相對應的兩種蛋白，構(gòu)成病毒的外膜。E2區(qū)C端相對保守，N端變異較大。N端有兩個高變區(qū)，即HVR1 和HVR2。由于該區(qū)中的HVR1易變性，使新的變異株可逃避機體的免疫攻擊，致使 HCV感染易慢性化，且給疫苗制造帶來困難[6]。因此研究包膜蛋白的抗原變異及宿主免疫應答規(guī)律，對HCV疫苗的研制和開發(fā)有重要的指導意義。

1.2 非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)(non-structural protein，NS)

非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)包括NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。

NS1基因編碼一段含有63個氨基酸的多肽 p7。Griffin等[7]研究證實，p7蛋白在HepG2細胞內(nèi)可以形成六聚體，構(gòu)成離子通道，對于病毒的成熟和釋放極為重要，同時可以作為抗病毒治療的潛在靶位。NS2基因編碼由 216個氨基酸組成的跨膜蛋白 p23。Ogata 等[8]研究認為，在某些特定條件下 NS2蛋白酶可以通過Trans方式介導裂解，實驗中觀察到 EDTA能抑制NS2/NS3蛋白酶的活性，而 Zn2＋可將其激活。NS3基因編碼含有631個氨基酸的p72蛋白。Jhaveri等[9]最近研究認為NS3 L106A和F43A位點突變可抑制絲氨酸蛋白酶活性，并阻礙NS3-p53復合物形成，可能成為抑制HCV復制及致癌性的新靶位。NS4基因位于HCV基因組第5313～6257 nt區(qū)段，其編碼的蛋白被加工處理為兩部分，即NS4A和NS4B。其主要作用包括抑制翻譯，調(diào)節(jié)NS5B RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)的活性等。NS4B主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，可以誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的網(wǎng)狀改變，為病毒復制復合體的形成提供支架[10]。NS5基因位于HCV基因組6528～9371 nt區(qū)段，編碼的蛋白被加工處理為兩部分，即 NS5A和 NS5B蛋白。Hiscott 等[11]研究證實，RNA依賴的 RNA聚合酶能在體外催化HCV RNA產(chǎn)生雙鏈RNA發(fā)夾樣分子，NS5B介導的RNA聚合酶通過還原拷貝機制，引發(fā)模板的延伸。

2 丙肝病毒的免疫逃逸機制

HCV逃避宿主免疫監(jiān)視，實現(xiàn)體內(nèi)持續(xù)感染的原因是復雜的:①病毒變異:病毒基因編碼的抗原不斷發(fā)生變異，產(chǎn)生新的HCV準毒株，逃避宿主的免疫監(jiān)視，這是導致HCV持續(xù)感染和慢性化的一個主要原因。②HCV病毒蛋白可以影響機體的免疫功能。基因型la 和1b的E2以及NS5A可以干擾IFN的應答，使病毒逃脫機體非特異性免疫反應，并導致IFN耐藥。NS3/ 4A阻斷病毒感染所誘發(fā)的IRF-3活化，抑制宿主的免疫反應。NS5B可下調(diào)MHC-I分子的表達，抑制T淋巴細胞的細胞毒作用，降低機體對感染HCV細胞的清除。③HCV對機體免疫細胞功能造成損害:包括B細胞、NK細胞、T細胞、樹突狀細胞相關(guān)的免疫損傷。事實上，丙肝病毒的免疫逃逸是通過細胞免疫和體液免疫兩個重要的途徑來進行的，如表1和表2分別通過T細胞應答和抗體免疫應答來簡要概括了丙肝病毒的免疫逃逸機制[12-27]。

表1 T細胞應答免疫逃逸機制Table 1 Mechanisms of escaping from T cell responses

表2 抗體免疫應答逃逸機制Table 2 Mechanisms of escaping from antibody responses

3 研制中的丙肝候選疫苗

3.1 治療性疫苗

3.1.1 重組蛋白疫苗(recombinant protein-based vaccines)

重組蛋白疫苗的原理是分離編碼靶蛋白的基因并在細菌、酵母或者哺乳動物細胞中進行表達，并分離、純化該重組蛋白。這類重組蛋白具有HCV特定的保護性抗原表位，可誘導機體產(chǎn)生抗病毒免疫應答.GI5005是一種治療性的蛋白疫苗產(chǎn)品，它是由加熱滅活的酵母細胞改造而來，同時混合了NS3和核心蛋白，可以誘導強烈的T細胞應答。Torresi等[28]研究表明:GI5005具有良好的耐受性，且能誘發(fā)明顯的特異性T細胞免疫應答。試驗組外周血內(nèi)病毒載量減少約1.41 g，而對照組減少量小于0.751 g。目前，GI5005聯(lián)合標準療法(SoC)的方案正在開展Ⅱ期臨床試驗，研究結(jié)果還未見公布[29]。

3.1.2 多肽疫苗(peptide-based vaccines) 多肽疫苗是按照病原體抗原基因中已知或預測的某段抗原表位的氨基酸序列，通過化學合成技術(shù)制備的疫苗。丙肝多肽疫苗經(jīng)由疫苗肽鏈，通過HLA分子識別把信息傳遞給T細胞受體，誘導HCV特異性T細胞免疫。它能通過多個表位來誘導CTL和Th免疫應答來防止免疫逃逸。一般情況下，這些疫苗免疫源性較弱，通常需要聯(lián)合佐劑來使用。IC41是一種多肽疫苗[30]，這種疫苗含有5種合成肽，包括1型和2型HCV核心抗原和NS3和NS4蛋白上的4個保守區(qū)，另外還包括4個已知的HLA-2A抗原表位及3個雜合CD4＋T細胞表位，再配以poly-L-arginine。Firbas等[31]的I期臨床試驗納入128例HLA-2A陽性受試者接受該疫苗注射，其研

究結(jié)果表明，該疫苗耐受性較好，能誘導T細胞應答。但是Klade等[32]的Ⅱ期臨床試驗結(jié)果顯示:IC41雖然可誘導CTL和Th細胞免疫應答，但作用甚微。

3.1.3 DNA疫苗(DNA-based vaccines) 質(zhì)粒DNA能編碼具有免疫原性的HCV蛋白或者各種大小的肽鏈抗原決定基，它直接應用于活體內(nèi)誘導體液免疫和細胞免疫反應，具有高度的適應性。CIGB-230作為首個治療性DNA疫苗，它融合了HCV核心蛋白及能表達HCV結(jié)構(gòu)蛋白的質(zhì)粒，已經(jīng)處于臨床研究的一期臨床試驗階段。有研究表明，該疫苗具有良好的耐受性，能誘導相關(guān)抗體及核心蛋白特異性T細胞應答[33]。第2 個DNA疫苗現(xiàn)在正處于Ⅱ期臨床試驗階段。

3.1.4 病毒載體疫苗(viral vector-based vaccines) 針對丙肝病毒RNA的病毒載體疫苗是一種有潛力的疫苗。通過腺病毒(adenovirus，Ad)、牛痘病毒、修飾的痘苗病毒安卡拉株(modified vaccinia Ankara，MVA)和禽痘病毒等病毒載體生產(chǎn)出HCV的各種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原可誘導T細胞應答。這種病毒疫苗與DNA疫苗相似，它不僅能編碼目標蛋白或者多肽，而且比DNA疫苗具有更強免疫原性。TG4040是一種病毒載體疫苗，由改造過的MVA的減毒載體再次改造而成，能表達NS3、NS4、NS5B等多種抗原。動物試驗研究顯示[34]，它能誘導小鼠機體產(chǎn)生分泌γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)的 T細胞及 CTL。Habersetzer 等[35]的Ⅰ期臨床研究顯示:TG4040能誘導產(chǎn)生分泌INF-γ的T細胞并能在體內(nèi)持續(xù)6個月。其Ⅱ期臨床試驗的已完成，但相關(guān)資料未見公開發(fā)表。

3.1.5 樹突細胞疫苗(dendritic cells-based vaccines)

樹突細胞疫苗目前被作為一種安全、有效、有前景的治療性疫苗，在體外通過將抗原或抗原基因?qū)霕渫患毎?dendritic cells，DCs)，使抗原表位與樹突細胞的MHC結(jié)合，呈現(xiàn)在細胞表面即成為樹突細胞疫苗。DC細胞作為抗原呈遞能力最強的細胞，可將提呈的抗原信息傳遞給T、B細胞，從而誘導體液免疫和細胞免疫應答[36]。將外源性抗原基因?qū)霕渫患毎^常用的方法應用重建病毒感染樹突細胞，復制缺陷性腺病毒載體和痘苗病毒載體是目前最常用的病毒載體。關(guān)于DCs疫苗的有效性和安全性的第一階段的臨床試驗已經(jīng)開展[37]。

3.1.6 類病毒顆粒疫苗(VLP-based vaccines) 類病毒顆粒疫苗(VLPs)可能是未來疫苗的發(fā)展方向，它通過表達HCV結(jié)構(gòu)蛋白的病毒樣顆粒誘導機體產(chǎn)生抗體和T細胞應答。這種疫苗已經(jīng)成功應用于人乳頭瘤病毒[38]和 HBV[39]感染，它能沉默病毒的持續(xù)感染。因為它的相對大小和重復的結(jié)構(gòu)，VLPs具有高度的免疫原性。此外，大多數(shù)的VLPs不需要通過佐劑來刺激免疫應答?？梢韵嘈牛痪玫膶眍惒《緲宇w粒疫苗(VLPs)也會應用于動物實驗和臨床研究。

3.2 預防性疫苗

目前，全球研制的主要丙肝病毒疫苗基本屬于治療性疫苗，但事實上預防性疫苗的研制具有更大的社會意義。理想中的預防性疫苗應能使機體對HCV及其變異型產(chǎn)生強烈的細胞免疫和體液免疫應答，一旦病毒入侵，可以達到根除病毒的目的。但是，從實際角度出發(fā)，進行預防性疫苗的研究有一定的風險，因為它可能讓健康的人體感染病毒，并且動物模型的實驗結(jié)果也不能完全代表臨床實驗。然而，如果這樣的疫苗一旦研制成功，那么在預防慢性感染方面將是一個可靠的選擇。以下將討論幾類正在研制中的預防性候選疫苗。

3.2.1 重組蛋白疫苗(recombinant protein-based vaccines) HCV E1E2疫苗是由HCV的E1E2蛋白聯(lián)合MF59C.1佐劑而成。有研究表明[40]，使用重組蛋白HCV E1E2，在黑猩猩體內(nèi)誘導交叉中和抗體(cross-nAbs)，能保護HCV感染的黑猩猩。Frey[41]的一期臨床試驗，入選60名健康志愿者，給予不同劑量的HCV E1E2蛋白(基因型為1a)，并聯(lián)合MF59C.1佐劑，研究結(jié)果顯示:實驗組能測量到E1和E2抗體的存在，實驗組和對照組在不良反應方面差異無統(tǒng)計學意義。另一種重組蛋白疫苗是HCV核心蛋白聯(lián)合佐劑(ISCOMATRIXTM)，目前也在進行Ⅰ期臨床試驗，有30個健康受試者入組。30例受試者中29例的體液免疫應答能被檢測到，抗體滴定度＞10[42]。

3.2.2 DNA疫苗(DNA-based vaccines) DNA疫苗可以通過編碼細胞表面包膜糖蛋白E2誘導體內(nèi)抗E2抗體發(fā)揮抗病毒作用。Forns[43]通過動物試驗發(fā)現(xiàn)，黑猩猩2768在3次免疫接種之后僅能產(chǎn)生低濃度的抗E2抗體，當出現(xiàn)HCV病毒感染時，免疫記憶功能就會啟動。其研究發(fā)現(xiàn)，丙肝病毒依然可以感染被疫苗接種過的黑猩猩，但是疫苗接種能解決早期的感染問題，而沒有接種疫苗的對照組動物出現(xiàn)慢性感染。DNA疫苗不能消除免疫反應，但是它似乎能減輕感染，阻止丙肝的慢性化。

3.2.3 病毒載體疫苗(viral vector-based vaccines) 病毒載體疫苗是利用腺病毒良好的免疫原性，通過選擇不感染人的血清型腺病毒(人類腺病毒6，Ad6；黑猩猩腺病毒3，ChAd3)來避免體內(nèi)現(xiàn)存的中和抗體(nAbs)的干擾。這種疫苗接種能直接誘導機體產(chǎn)生強烈的T細胞免疫應答。有研究表明[44]，MRKAd6NSmut和 DNA boosts在能產(chǎn)生顯著的CD4＋T和CD8＋T反應。所有被感染HCV的動物，其HCV復制水平低于100倍。4/5接種免疫的黑猩猩能夠清除病毒，與未接種疫苗的動物相比，接種疫苗的黑猩猩能夠顯著縮短病毒血癥的時間。在所有免疫接種的動物中，肝臟的轉(zhuǎn)氨酶未見明顯升高。以黑猩猩源腺病毒 3(chimpanzee adenovirus 3，ChAd3)和人源腺病毒 Ad6為載體[45]，把HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3-NS5B區(qū)插入腺病毒載體，可以誘導 T細胞產(chǎn)生 IL-1、IFN-γ和腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor α，TNF-α)，具有較好的有效性和安全性。

3.2.4 病毒樣顆粒疫苗(VLP-based vaccines) 重組蛋白疫苗在先前疫苗的設(shè)計上存在不足之處，主要困難在于蛋白質(zhì)的正確折疊和產(chǎn)生過程。為了克服這些問題，Elmowalid[46]研制了病毒樣顆粒疫苗(VLPs)，作為一種有潛力的候選疫苗，它能表達HCV結(jié)構(gòu)蛋白。在研究中，所有注入VLPs的試驗動物均能產(chǎn)生CD4＋T 和CD8＋T細胞免疫應答。4只被感染HCV的黑猩猩有3只黑猩猩在10周能完全清除體內(nèi)病毒，1只黑猩猩存在低劑量的HCV RNA病毒滴度。

4 展望

新型直接抗病毒藥物(DAAs)的出現(xiàn)將HCV的抗病毒治療提高到了一個新的水平，但是疫苗的研制和發(fā)展仍然具有重要的臨床意義，尤其是對于那些HCV廣泛流行區(qū)域的人們以及那些抗病毒治療效果不佳的患者。通過更好地理解有效免疫應答的相關(guān)性，HCV疫苗的研制已經(jīng)取得實質(zhì)性進展。到目前為止，一些頗具前景的候選疫苗(如表3)已經(jīng)進入動物實驗或臨床試驗，但是有關(guān)這些疫苗的有效期和安全性的研究數(shù)據(jù)還十分有限，目前還沒有疫苗進入臨床Ⅲ期試驗。基于肽鏈或者蛋白的T細胞疫苗僅僅能產(chǎn)生微弱的T細胞應答，這一應答過程很可能是通過佐劑的作用來適當提高免疫應答而不產(chǎn)生嚴重的副作用。DNA疫苗能產(chǎn)生有限的體液免疫和細胞免疫應答，這一過程需要佐劑來提高疫苗的免疫原性。病毒樣顆粒疫苗(VLPs)存在很多免疫原性特征，是目前最有前景的HCV待選疫苗。迫切需要一種有效的疫苗來治療這種疾病，從而減輕全球的負擔。隨著有效的免疫應答被進一步研究清楚，相信將來定會研制出一種有效的疫苗來解決這些困難。

表3 進入動物實驗和臨床試驗的候選疫苗Table 3 Candidate vaccines in preclinical animal experiments and clinical trials

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(責任編輯:王昌棟)

Progress on the genome，immune-evasion and vaccines of hepatitis C virus

ZHANG Chengcheng1，ZHANG Li2，ZHANG Wenjun1，3
(1.Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Zhongshan Ophthalmic Center，Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510060，China；3.State Key Laboratory of Virology，Wuhan University，Wuhan 430072，China)

Standard-of-care(SoC)therapy and new antiviral agents for hepatitis C are inadequate and expensive with lots of side effects.Great progress has been made on the HCV vaccine with the development of biotechnology.Although there is no HCV vaccine that can be directly used in the clinical treatment at present，we still have great therapeutic and prophylactic prospect on HCV vaccine.In this review，we will mainly discuss the characteristics of the HCV gene，related immune mechanisms of escape and promising HCV vaccine candidates.

hepatitis C virus；genome；immune-evasion；vaccine

R186

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.028

1006-8783(2015)05-0682-06

2015-06-29

中國博士后科研基金(2013M540601)

張成成，女，2013級碩士研究生，Email:313797228＠qq.com；通信作者:張文軍，男，副教授，碩士生導師，主要從事病原生物的致病作用及防治研究，Email:zhangwj＠gdpu.edu.cn。

時間:2015-09-22 16:23

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150922.1623.002.html